HPLC法同時(shí)測定三味龍膽花片中馬錢苷酸和異金雀花素的含量

艾悅言 趙學(xué)勇 付林 卞曉蓮 古銳 張靜波 南措 西繞娜姆

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）20-2810-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.16

摘 要 目的：建立同時(shí)測定三味龍膽花片中馬錢苷酸、異金雀花素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Inertsil ODS-3，流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為240 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：馬錢苷酸和異金雀花素進(jìn)樣量線性范圍分別為0.040 08～4.008 0 μg（r=0.999 9）、0.021 96～2.196 0 μg（r=0.999 9）；定量限分別為0.160 32、0.087 8 ng/mL，檢測限分別為0.080 16、0.043 92 ng/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%；加樣回收率分別為103.07%～104.26%（RSD=0.52%，n=6）、95.57%～99.61%（RSD=1.55%，n=6）。結(jié)論：該方法簡便、精確，可用于同時(shí)測定三味龍膽花片中馬錢苷酸和異金雀花素的含量。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；三味龍膽花片；馬錢苷酸；異金雀花素；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of loganic acid and isoscoparin in Sanwei longdanhua tablets. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Inertsil ODS-3 column with mobile phase consisted of methanol-0.2% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 240 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range were 0.040 08-4.008 0 μg （r=0.999 9） for loganic acid and 0.021 96-2.196 0 μg （r=0.999 9） for isoscoparin. The quantitative limits were 0.160 32 and 0.087 8 ng/mL， and detection limits were 0.080 16 and 0.043 92 ng/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The recoveries were 103.07%-104.26%（RSD=0.52%，n=6） and 95.57%-99.61%（RSD=1.55%，n=6）. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate and suitable for simultaneous determination of loganic acid and isoscoparin in Sanwei longdanhua tablets.

KEYWORDS HPLC； Sanwei longdanhua tablets； Loganic acid； Isoscoparin； Content determination

三味龍膽花片為國藥準(zhǔn)字藏藥，處方中主要含白花龍膽、甘草等，具有清熱、潤肺的作用，可用于肺熱氣喘和咽喉炎等癥的治療。該制劑在國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)中已有含量測定項(xiàng)目，但僅以甘草有效成分甘草酸為測定指標(biāo)，而甘草在該制劑中為調(diào)和藥性的藥物，并非君藥。該制劑處方中君藥為白花龍膽[1]，此藥材在藏、蒙、阿薩克等民族藥中均被廣泛應(yīng)用[2-4]，具有瀉肝膽實(shí)火、止咳利咽、舒筋止痛、健胃等功效，主治肺熱咳嗽及目赤咽痛等癥[5-7]。因此，有必要以白花龍膽有效成分為含量測定指標(biāo)來建立該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)文獻(xiàn)指出，白花龍膽是多基源藥材，來源于大花龍膽（Gentiana szechenyii Kanitz）和高山龍膽（G. algida Pall.），但上述兩種植物成分存在較大差異[8-13]。經(jīng)過成分比較研究與分離鑒定表明，環(huán)烯醚萜類的馬錢苷酸（Loganic acid）和黃酮類的異金雀花素（Isoscoparin）是兩種源自白花龍膽的共有成分[14-16]。因此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定了三味龍膽花片中馬錢苷酸和異金雀花素的含量，旨在為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010A（HT）型HPLC儀，包括四元泵、柱溫箱、紫外檢測器、LC Solution色譜工作站（日本Shimadzu公司）；SB-5200型超聲波清洗器（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；BSA124S型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；FA1004型十萬分之一電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；ULUP-1-10T型超純水機(jī)（成都優(yōu)普超純水科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

馬錢苷酸對照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS0330-0025，純度：>98%）；異金雀花素對照品（成都普思生物科技股份有限公司分離鑒定的對照品，純度：>98%）；三味龍膽花片（宇妥藏藥股份有限公司，批號：170401、1710021037、1710031052、1710051035、1710061035、1710071003、1710071035，規(guī)格：0.5 g/片）；甲醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；甲醇[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；磷酸（諾爾施HPLC級，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，21% A→25% A；5～15 min，25% A→28% A；15～35 min，28%A→40%A；35～45 min，40% A→46% A；45～50 min，46%A→21% A；50～55 min，21% A）；檢測波長：240 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，馬錢苷酸、異金雀花素峰理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，陰性對照對測定無干擾，詳見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取馬錢苷酸、異金雀花素對照品各適量，加75%甲醇溶解并稀釋，制成含馬錢苷酸0.400 8 mg/mL、異金雀花素0.219 6 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品10片，除去包衣，研細(xì)，精密稱取0.5 g，加75%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理45 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按三味龍膽花片的處方和工藝制備不含白花龍膽的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，加75%甲醇制成馬錢苷酸質(zhì)量濃度分別為0.400 8、0.080 16、0.040 08、0.016 032、0.008 016、0.004 008 mg/mL，異金雀花素質(zhì)量濃度分別為0.219 6、0.043 92、0.021 96、0.008 784、0.004 392、0.002 196 mg/mL的線性關(guān)系工作溶液。精密量取上述線性關(guān)系工作溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得馬錢苷酸回歸方程為y=1 570 514.938 7x+23 270.548 7（r=0.999 9），異金雀花素回歸方程為y=2 164 949.062 0x+4 886.334 6（r=0.999 9）。結(jié)果表明，馬錢苷酸、異金雀花素進(jìn)樣量線性范圍分別為0.040 08～4.008 0、0.021 96～2.196 0 μg。

2.4 定量限與檢測限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測限。結(jié)果，馬錢苷酸、異金雀花素的定量限分別為0.160 32、0.087 8 ng/mL，檢測限分別為0.080 16、0.043 92 ng/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下線性關(guān)系工作溶液（馬錢苷酸質(zhì)量濃度為0.080 16 mg/mL、異金雀花素質(zhì)量濃度為0.043 92 mg/mL）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，馬錢苷酸、異金雀花素峰面積的RSD分別為0.076%、0.832%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：1710071035）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，馬錢苷酸、異金雀花素峰面積的RSD 分別為0.590%、1.950%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號：1710071035）細(xì)粉適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，馬錢苷酸、異金雀花素的平均含量分別為2.216、1.340 mg/g，RSD分別為1.314%、1.190%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號：1710071035）細(xì)粉0.25 g，共6份，分別加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

分別取7批樣品細(xì)粉各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

試驗(yàn)前期，筆者比較了50%甲醇、75%甲醇、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯5種提取溶劑對含量測定的影響。結(jié)果顯示，以50%甲醇和75%甲醇提取時(shí)，馬錢苷酸、異金雀花素兩種成分含量相近且較高，但由于以50%甲醇超聲提取后用微孔濾膜濾過時(shí)十分困難難以制樣，故選擇75%甲醇為提取溶劑。筆者又比較了25、50、75、100 mL 4種不同提取溶劑量對含量測定的影響，結(jié)果顯示，提取溶劑量為25 mL時(shí)馬錢苷酸、異金雀花素兩種成分含量均最高。另外，筆者還比較了超聲15、30、45、60 min和回流30 min 5種方式對提取效率的影響，結(jié)果顯示，超聲45 min時(shí)提取效率最高。

在色譜條件的選擇方面，最初選擇乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相進(jìn)行洗脫，結(jié)果顯示，馬錢苷酸與異金雀花素峰分離度和峰形均不好；而改用甲醇-0.2%磷酸溶液為流動相后，馬錢苷酸與異金雀花素峰的分離度均大于1.5且峰形均較好。另外，筆者用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，馬錢苷酸在240 nm波長處有最大吸收，異金雀花素雖在210、280、350 nm波長處有最大吸收，但其在240 nm波長處的峰形較好且吸收也較大，故選擇檢測波長為240 nm。

綜上所述，本方法簡便、精確，可用于同時(shí)測定三味龍膽花片中馬錢苷酸和異金雀花素的含量。

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（收稿日期：2018-04-23 修回日期：2018-08-28）

（編輯：陳 宏）