玉米細(xì)胞分裂素Zmrr3的克隆及RNAi載體的構(gòu)建

齊璐璐 馬慶

摘要 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)從魯原92自交系玉米基因組中擴(kuò)增了Zmrr3基因的第5外顯子特異性片段，并以測(cè)序過(guò)的目的片段構(gòu)建了RNAi的載體pCAMBIA303+RNAi+2F，該載體還有潮霉素、卡那霉素、GUS等篩選基因。可以用于細(xì)胞分裂素調(diào)控葉序變化的分子機(jī)制研究。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞分裂素；小干涉RNA；表達(dá)載體的構(gòu)建；玉米

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-3305（2018）03-003-03

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.03.002

Abstract The PCR technique was used to amplify the exonspecific segments of Zmrr3 gene from Luyuan 92 of maize genome， and the Expression Vector with RNAi expression pCAMBIA303+RNAi+2F was constructed with the sequence of the target fragment， which contains Hygromycin， kanamycin kanamycin and GUS slective gene. It can be used to study the relation between cytokinins and phyllotaxis of Maizet in molecular mechanism.

Key words Zmrr3 gene； Small interference RNA； Construction of expression vector； Maize

玉米是禾本科黍?qū)伲╖ea）中僅有的一個(gè)種（Mays）。國(guó)內(nèi)關(guān)于對(duì)生玉米的性狀具體研究早在1971年時(shí)就有過(guò)報(bào)道，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的重要基因和內(nèi)外環(huán)境可能是植物葉發(fā)育進(jìn)過(guò)程中的兩大重要因素。而在玉米對(duì)生葉序突變體的研究發(fā)現(xiàn)其內(nèi)源細(xì)胞分裂素的水平升高是對(duì)生突變的重要特征，但是這個(gè)結(jié)果還不能清楚解釋葉序排列是如何發(fā)生的。美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室的研究報(bào)道認(rèn)為在玉米中細(xì)胞分裂素調(diào)控基因Zmrr3發(fā)生轉(zhuǎn)座導(dǎo)致了其葉序?qū)ι男纬伞BPH蛋白是細(xì)胞分裂素調(diào)控基因Zmrr3的表達(dá)產(chǎn)物，只要是通過(guò)植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)，在內(nèi)源細(xì)胞分裂素的作用下其在玉米頂端分生組織的空間表達(dá)迅速改變，因此會(huì)造成葉原基排布的變化。為進(jìn)一步了解在玉米葉原基分化類型轉(zhuǎn)換的調(diào)控中外源細(xì)胞分裂素所起的作用，設(shè)計(jì)了對(duì)玉米胚添加不同濃度的細(xì)胞分裂素處理，最終互生玉米幼胚莖尖分生組織位點(diǎn)在較高濃度的外源細(xì)胞分裂素的處理下發(fā)生膨大，但并未改變成對(duì)生植株，這可能與可獲得的玉米胚材料葉原基已經(jīng)形成有關(guān)。

RNA干涉是指雙鏈RNA在是指由短雙鏈 RNA 誘導(dǎo)的同源 RNA 降解，從而導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表現(xiàn)型缺失的現(xiàn)象。Cioppa 等人為篩選煙草耐旱或抗病等優(yōu)良性狀，用煙草 mosaic 病毒導(dǎo)入了不同的遺傳序列，進(jìn)而系統(tǒng)地進(jìn)行基因敲除來(lái)實(shí)現(xiàn)。Knutzon等向油菜中導(dǎo)入硬脂酸ACP脫飽和酶的反義基因，結(jié)果直接使得其種子硬脂酸含量由2%提高到40%且轉(zhuǎn)基因植株生活力正常。在植物的遺傳發(fā)育及作物的抗病及優(yōu)良品種選育等領(lǐng)域，RNAi應(yīng)用的比較廣泛。因此，為驗(yàn)證細(xì)胞分裂素與玉米葉序類型之間的關(guān)系，該次試驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建了細(xì)胞分裂素調(diào)控基因Zmrr3RNAi載體，以期為進(jìn)一步研究細(xì)胞分裂素與葉序類型轉(zhuǎn)換之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 作物材料 互生玉米自交系魯源92葉片。

1.1.2 菌種及質(zhì)粒 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌DH5α、載體pCAMBIA1303安徽省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；農(nóng)桿菌 LBA4404，中科院等離子體物理研究所植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；質(zhì)粒pUCCRNAi，中科院遺傳所提供。

1.1.3 酶及試劑 MgCl2、PCR buffer、dNTPs、和Taq DNA聚合酶，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶，購(gòu)自 Takara大連寶生物工程有限公司，PCR Marker DL2000和Genome DNA Markerλ＼HindⅢ，購(gòu)自Takara公司；AS（乙酰丁香酮）、TrisHCl和RNase，購(gòu)自Promega公司；DNA抽提純化試劑盒，購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司；其他常用藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭akara大連寶生物工程有限公司完成PCR引物由合成，上海博亞生物工程公司完成測(cè)序服務(wù)。

1.2 細(xì)胞分裂素Zmrr3基因片段的PCR擴(kuò)增

通過(guò)NCBI網(wǎng)站獲取玉米細(xì)胞分裂素調(diào)控基因Zmrr3的全長(zhǎng)基因序列和cDNA序列。運(yùn)用clustal W軟件對(duì)以上序列進(jìn)行同源性搜索和比對(duì)分析，確定目的基因片段序列為玉米Zmrr3基因的第5個(gè)外顯子特異序列共86 bp。分別在正、反向上游引物的5分別添加了BamHⅠ。正向下游、引物的5分別添加了NcoⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)，反向下游引物的5添加了XbaⅠ位點(diǎn)，采用手工設(shè)計(jì)，并利用引物設(shè)計(jì)程序進(jìn)行輔助分析。（目的片段加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基后的總大小如下， 正向片段109 bp； 反向片段103 bp）

正、反向上游引物：5ATAGGATCCGCGGCAAGTAGTAGCACAGC3

正向下游引物：5CCTCTAGACCATGGAATGCCGCTGCTACAGCTAC3

反向下游引物：5CCTCTAGAAATGCCGCTGCTACAGCTAC3

劃線部分為酶切位點(diǎn)，其評(píng)估與優(yōu)化工作由Primer Design程序完成。

通過(guò)Biometra96梯度PCR儀擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μl）：ddH2O，37.6 μl；3primer（10 μmol/L），2 μl；5primer（10 μmol/L），2 μl；dNTP（10 mmol/L），1 μl；10×PCR buffer（包括MgCl2）， 5 μl； Template（50 ng/μl），2 μl；Taq DNA polymerase（5 U/μl），0.4 μl。

PCR優(yōu)化反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，62.5℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

擴(kuò)增后的產(chǎn)物在含有0.5 μg/ml溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為5 V/cm，電泳結(jié)果由Kodark凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄分析。

1.3 PCR產(chǎn)物的克隆、篩選和序列分析

PCR產(chǎn)物電泳回收后，與pMD18T vector以3∶1的比例，加Ligation Solution I 4.0 ml混勻，l6℃反應(yīng)過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑選白斑用堿裂解法提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒，其中插入的目的基因，測(cè)序完成后用DNASIS軟件進(jìn)行核酸序列分析。

1.4 siRNA表達(dá)載體的建立

將pUCCRNAi質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物分別用XbaⅠ、BamHⅠ雙酶切，酶切反應(yīng)體系為20 μl，具體為：pUCCRNAi或純化的PCR片段1 μl，10×bufferM 8 μl，XbaⅠ1 μl，1%BSA 0.1μl，電動(dòng)混勻，37℃保溫6 h，60℃滅活15 min。再加入ddH2O 7 μl，10×bufferK 2 μl，BamHⅠ 1 μl，電動(dòng)混勻，30℃保溫3 h，60℃滅活15 min，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒚盖泻蟮妮d體與擴(kuò)增產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠上電泳，并且將膠純化回收的片段置于16℃連接過(guò)夜，連接反應(yīng)體系如表1所示。

將PCR擴(kuò)增的目的基因片段和pUCCRNAi質(zhì)粒分別用BamHⅠ、XbaⅠ酶切、連接，得重組質(zhì)粒pUCRNAi+1F，并酶切驗(yàn)證；對(duì)重組質(zhì)粒pUCRNAi+1F進(jìn)行BglⅡ、SpeⅠ雙酶切，再與用BamHⅠ、NcoⅠ雙酶切的目的片段連接，從而構(gòu)建成含有正反目的片段的pUCRNAi+2F載體，酶切驗(yàn)證同上。然后對(duì)pUCRNAi+2F載體進(jìn)行SpeⅠ與NcoⅠ雙酶切，回收目的片段，然后與經(jīng)過(guò)SpeⅠ與NcoⅠ雙酶切雙酶切的pCAMBIA1303載體進(jìn)行連接，構(gòu)建成pCAMBIA1303+RNAi+2F載體如圖1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因片段的獲得

采用CTAB法提取自交系魯原92玉米葉片基因組，通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測(cè)如圖2所示，表明提取的玉米基因組主帶清晰，OD260/OD280均在1.8～2.0之間，符合試驗(yàn)要求。

2.2 細(xì)胞分裂素Zmrr3基因片段擴(kuò)增

使用引物1和2擴(kuò)增Zmrr3基因的第5個(gè)外顯子片段， 并通過(guò)于3.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示，分別得到與預(yù)期目的片段大小一致的單一擴(kuò)增帶。pMD18T載體與擴(kuò)增目的條帶回收后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。篩選出陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切分析，分別得到103 bp和109 bp大小的2條片段。說(shuō)明按預(yù)期設(shè)計(jì)，該目的基因插入到載體上。并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證了其正、反序列與已發(fā)表的基因一致。

2.3 pCAMBIA1303+RNAi+2F載體的構(gòu)建

Zmrr3基因PCR擴(kuò)增的109 bp的正向片段和pUCCRNAi質(zhì)粒分別用XbaⅠ、BamHⅠ酶切、連接，篩選重組質(zhì)粒pUCRNAi+1F，并通過(guò)PstⅠ酶切鑒定，得到一條約362 bp特異帶，證明109 bp的干涉片段已經(jīng)正向連接在pUCCRNAi載體上。對(duì)重組質(zhì)粒pUCRNAi+1F進(jìn)行BglⅡ、 SpeⅠ雙酶切，然后與NcoⅠ、 BamHⅠ雙酶切的103 bp的反向目的片段連接，PstⅠ酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pUCRNAi+2F，得到465bp的特異帶，表明反向干涉片段已反接到pUCCRNAi載體上，如圖4所示。

對(duì)SpeⅠ、NcoⅠ雙酶切后的pUCRNAi+2F載體和pCAMBIA1303載體連接，構(gòu)建成pCAMBIA1303+RNAi+2F載體。并通過(guò)酶切（XhoⅠ）驗(yàn)證構(gòu)建pCAMBIA1303+RNAi+2F載體，得到1 094 bp特異帶如圖5所示。表明pUCRNAi+2F片段已連接到pCAMBIA1303載體上，從而方便以后將目的片段通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入玉米優(yōu)良自交系。

3 結(jié)論與討論

RNA干涉技術(shù)發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的相關(guān)基因的功能研究。如果后續(xù)Zmrr3干涉的載體轉(zhuǎn)化能夠達(dá)到預(yù)期結(jié)果，即可以直觀地觀察到葉序的變化時(shí)，那么也可以考慮將載體中的正反干涉片段作為一種篩選標(biāo)記基因整合到欲轉(zhuǎn)化的載體上，通過(guò)轉(zhuǎn)化過(guò)程中抑制細(xì)胞分裂素調(diào)控基因的表達(dá)導(dǎo)致葉序的轉(zhuǎn)變來(lái)起到篩選的作用。其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為以下2點(diǎn)：①篩選方便，可直接根據(jù)觀測(cè)到的葉序類型的變化來(lái)判斷是否轉(zhuǎn)入到受體植株中；②安全，高效。普遍使用的常規(guī)抗生素篩選標(biāo)記，如氨卞青霉素、卡那霉素、潮霉素等，其在篩選過(guò)程中均會(huì)造成不少轉(zhuǎn)基因植株的死亡，從而在不同程度上影響了轉(zhuǎn)基因的效率。而若使用干涉片段作為篩選標(biāo)記時(shí)，該環(huán)節(jié)的損失相對(duì)有所減少，提高了轉(zhuǎn)基因的效率。

此外，椐報(bào)道RNAi介導(dǎo)的基因沉默可能受環(huán)境的影響，基因沉默可能收到溫度方面的影響。溫度越低，基因沉默越易受到抑制， siRNAs 同時(shí)也會(huì)隨之降低；反之，溫度越高， 基因沉默越容易被激活，且siRNAs也隨之增加。所以在后續(xù)的載體保存和轉(zhuǎn)化中還應(yīng)注意試驗(yàn)溫度的影響。

有研究報(bào)道有些植物對(duì)卡那霉素不敏感，玉米也是其中之一，但很多文獻(xiàn)報(bào)道玉米、小麥等對(duì)潮霉素較敏感，因此潮霉素是玉米等作物轉(zhuǎn)基因植株較理想的篩選標(biāo)記。該次試驗(yàn)中構(gòu)建的細(xì)胞分裂素Zmrr3干涉的表達(dá)載體中含有潮霉素抗性基因，并且還含有GUS檢測(cè)基因，利用GUS作為報(bào)告基因，為后續(xù)轉(zhuǎn)化體的瞬時(shí)檢測(cè)提供了方便。

參考文獻(xiàn)

[1] Li LY， Yan CQ， Zhang MC，et al. Study Progress in Oppositifolious Maize[J]. Journal of Maize Sciences， 2004，12：21-25.

[2] 馬慶，齊璐璐，李曉玉，等.對(duì)生和互生玉米內(nèi)源激素含量的差異分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，16（6）：995-1000.

[3] A GIULINI， J WANG， D JACKSON. Control of phyllotaxy by the cytokinininducible response regulator homologue ABPHYL1[J].Nature， 2004， 430（7003）： 1031-1034.

[4] 井長(zhǎng)勤，張秀華，劉涌濤.RNA干涉技術(shù)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（13）：3780-3781，3794.

[5] 項(xiàng)艷，朱蘇文，程備久.RNA干涉技術(shù)（RNAi）應(yīng)用研究進(jìn)展[J].激光生物學(xué)報(bào)，2003，12（6）： 460-462.

[6] 王彥霞，劉正杰，馬峙英，等. RNA干涉技術(shù)干涉技術(shù)與棉花高油育種[J].棉花學(xué)報(bào)，2011， 32（2）：178-183.

責(zé)任編輯：劉赟