不同濃度的石榴皮多酚軟膏對兔耳粉刺模型組織病理形態學的影響

胡彬 楊逸璇 楊婉婷 王峰 陶夢穎 朱明芳

〔摘要〕 目的 觀察不同濃度的石榴皮多酚軟膏對兔耳粉刺模型組織病理形態學的影響，確定痤瘡治療的最佳石榴皮多酚軟膏濃度。方法 采用家兔左、右外耳道外緣處約2.0 cm×2.0 cm范圍涂抹2%煤焦油溶液約0.5 mL，1次/d，連續2周以制成動物粉刺模型。將不同濃度（18%、9%、3%）的石榴皮多酚制備成軟膏，均勻涂抹于兔耳粉刺模型，2次/d，連續4周。取材后在光鏡下觀察兔耳粉刺模型組織病理形態的變化。結果 石榴皮多酚中劑量組與陽性藥物（異維A酸）組對粉刺模型病理組織形態學兔耳炎癥程度、角化程度、毛囊擴張程度的影響最為顯著；模型組與空白組相比，兔耳炎癥、角化、毛囊擴張顯著（P<0.01）；與模型組相比，石榴皮多酚中劑量組與陽性藥物組均能顯著降低兔耳炎癥程度、角化程度、毛囊擴張程度（P<0.01）；石榴皮多酚高劑量組與石榴皮多酚低劑量組也能降低兔耳兔耳炎癥程度、角化程度、毛囊擴張程度（P<0.05），但不如石榴皮多酚中劑量組與陽性藥物組（P<0.05）。結論 石榴皮多酚中劑量組及陽性藥物組對兔耳粉刺模型的抗角化及抗炎作用最顯著。

〔關鍵詞〕 石榴皮多酚軟膏；抗角化；粉刺；組織病理學

〔中圖分類號〕R285.5；R758.73+3 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.008

〔Abstract〕 Objective To observe the different concentration of pomegranate peel polyphenols ointment on histopathologic morphology in rabbit ear acne model， and to determine the best concentration of pomegranate peel polyphenols ointment on acne. Methods The 2% coal tar daub solution about 0.5 mL was smeared at about 2.0 cm x 2.0 cm range of rabbit left and right outer edge， once daily for two weeks to make rabbit ear acne model. The different concentration （18%， 9%， 3%） of pomegranate peel polyphenols ointment was prepared， which was smeared evenly on the rabbit ear acne model， twice daily for four weeks. The histopathologic changes were observed under light microscopy. Results The medium dose of pomegranate peel polyphenols group and the control group （isotretinoin） showed the most obvious effect on the pathological histology of acne model in the degree of inflammation， keratinization， hair follicles expansion. Compared with blank group， the degree of inflammation， keratinization， hair follicles expansion of model group was more significant （P<0.01）. Compared with the model group， the medium dose of pomegranate peel polyphenols group and the control group could significantly decrease the degree of inflammation， keratinization， hair follicles expansion （P<0.01）； the low dose and high dose of pomegranate peel polyphenols groups also could obviously decrease the degree of inflammation， keratinization， hair follicles expansion （P<0.05）， the decreased degree in which was lower than medium dose of pomegranate peel polyphenols group and the control group （P<0.05）. Conclusion The medium dose of pomegranate peel polyphenols group and the control group show the most significant anti-keratinization and anti-inflammatory effect on the rabbit ear acne model.

〔Keywords〕 pomegranate peel polyphenols ointment； anti-keratinization； acne； histopathology

痤瘡（acne）是一種發生在青少年和成人中常見的毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，好發于顏面及胸背部皮脂腺，形成毛囊性丘疹、結節、膿皰、囊腫、瘢痕等[1]。目前，西醫治療痤瘡的主要藥物包括維甲酸類藥物、抗生素類、抗雄激素和雌性激素類藥物、糖皮質激素、鋅制劑等[2-5]，以上治療雖可使癥狀明顯減輕，但還是出現諸多問題，如癥狀易反復、副作用大、療程長、耐藥性及致畸性等，例如異維A酸[6]在臨床使用中可發生唇炎、眼干、鼻黏膜干燥等皮膚黏膜反應[7-9]。由此可見，西藥的不良反應及副作用大大降低了患者的依從性，從而使臨床應用局限[10]。近年來，中醫藥治療痤瘡，療效明顯，且劑型多樣，副作用小，來源豐富，很受患者的青睞。因此，中藥制劑治療痤瘡的研究已成為皮膚科研究中的熱點，導師朱明芳臨床應用發現無論是內服還是外用石榴皮治療痤瘡都有較好療效，而以石榴皮為主的多種中藥打粉制成面膜療效尤為顯著，經前期研究得出石榴皮中石榴皮多酚起著決定性的作用[11]。因此，本研究觀察了不同濃度石榴皮多酚軟膏對痤瘡治療的療效，并確定最佳濃度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級新西蘭大耳白兔42只，雌雄各半，體質量（2.5±0.5） kg，湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，每只分籠圈養于動物中心實驗室兔豚鼠實驗室。飼養溫度20～25 ℃，濕度50%～70%。

1.2 主要試劑

煤焦油（上海源葉生物科技有限公司），0.025%維A酸乳膏（重慶華邦制藥股份有限公司），自制高、中、低濃度石榴皮多酚軟膏[按處方量分別稱取十二烷基硫酸鈉0.250～0.375 g、甘油10 g、白凡士林4.5 g、十八醇5 g、單硬脂酸甘油酯 5 g、液體石蠟 3 g、硬脂酸2.5～3.5 g、月桂氮酮1.2～1.8 g，水適量，總量至100 g。水油兩相分別水浴加熱至70～80 ℃，攪拌至熔融。將水相以細流狀緩緩加入油相中，70～80 ℃水浴下持續攪拌10 min，室溫下繼續攪拌至冷凝，得水包油（O/W）型軟膏基質]。無水乙醇、0.9%氯化鈉注射液、10%水合氯醛、4%多聚甲醛，均為谷歌生物（長沙）生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器

ES-1000E 型電子天平（湖南長沙湘平科技發展有限公司）；Sigma1-15K高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；雙目倒置顯微鏡（OLYMPUS公司）；3 mm直徑打孔器等。

1.4 動物造模[12]

將新西蘭大耳兔在適應性喂養1周后，于第2周開始在左、右外耳道外緣處約2.0 cm×2.0 cm范圍涂抹2%煤焦油溶液約0.5 mL，1次/d（煤焦油臨時用95%酒精配制成2%的煤焦油溶液），連續2周以制成動物粉刺模型。

1.5 實驗分組與干預

42只兔隨機分為7組，為空白組、模型組、基質組、陽性組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。空白組正常飼養，其余6組均于第2周給予造模處理，造模成功后于第4周開始干預，空白組和模型組給予0.1 mL生理鹽水涂抹兩耳；基質組每日在兔耳角化處涂0.1 g的基質（不含石榴皮多酚）；高劑量、中劑量、低劑量組每日于左右角化處分別涂0.1 g的濃度為18%、9%、3%的石榴皮多酚軟膏（90%石榴皮多酚購自陜西騰邁生物科技有限公司，軟膏基質于湖南中醫藥大學藥學院自制）。陽性組每天于左右耳角化處涂0.025%維A酸乳膏0.1 g。每天涂2次，連續3周，給藥部位均為兔耳造模處。

在第42天，即末次給藥24 h后取材，取材時烏拉坦耳緣靜脈緩慢注射麻醉，待動物進入麻醉狀態后，用3 mm直徑打孔器制備左右耳涂煤焦油處的4個耳片，用10%的福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，于光鏡下觀察組織變化，拍照，測量。

1.6 指標測定

光鏡下觀察各組組織病理學表現，主要集中在炎性細胞浸潤、角質層厚度、皮脂腺大小、毛囊擴張程度等方面。光鏡下隨機選5個高倍視野測量角質層厚度、皮脂腺長短徑、炎性細胞浸潤程度、毛囊擴張程度。按以下標準進行評分和分級[13]。炎性細胞評分與分級標準，正常：無炎性細胞浸潤；輕度：局部性炎細胞浸潤，細胞散在（1分）；中度：局灶性炎細胞浸潤，細胞較密集，或出現多個浸潤灶（2分）；重度：彌漫性炎細胞浸潤（3分）。毛囊擴張程度評分與分級標準，正常：與空白組相同（0分）；輕度：角化物質增多，但不致密，且為未充滿毛囊（l分）；中度：角化物質致密，但為充滿毛囊；或角化物質不致密，但充滿毛囊（2分）；重度：角化物質致密，充滿毛囊（3分）。

1.7 統計方法

統計學分析采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料進行正態性檢驗。符合正態分布者，采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD法，方差不齊采用非參數檢驗。計數資料采用卡方檢驗進行描述統計，用卡方檢驗進行數據分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同濃度石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳組織病理學的影響

空白組兔耳皮膚上皮結構完整，細胞無水腫，排列整齊，深層毛囊、皮脂腺、汗腺組織無炎癥細胞浸潤，毛囊壁無反應性增生等情況。模型組兔耳皮膚上皮明顯充血腫脹，細胞結構不完整，排列欠連續；表皮下角質層結構排列不規則，局部出現增生增厚；深層毛囊、皮脂腺、汗腺組織有大量炎癥細胞浸潤，毛囊壁反應性增生增厚嚴重，毛囊內出現大量組織沉積物，皮脂腺結構呈現反應性增大，角質化嚴重；血管內皮出現細胞腫脹，充血，有反應性增生；耳廓間質纖維組織有纖維化傾向，有大量單核細胞、中性粒細胞浸潤，出現急慢性炎癥改變。基質組在角質化及毛囊增生、炎癥反應方面與模型組表現類似。低劑量組、高劑量組兔耳皮膚組織病理學觀察與模型組有一定的區別，炎癥程度、毛囊增生程度等較模型組減輕，呈現一定的治療作用。中劑量組、陽性藥物組從組織病理染色結果來看療效比較顯著，主要體現在減輕角質化程度、局部組織充血、炎性程度等方面。見圖1。

2.2 不同濃度石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳炎性細胞浸潤程度的影響

各組大鼠炎性細胞浸潤程度分級及評分結果見表1，在炎性細胞浸潤程度分級上模型組與空白組經卡方檢驗，2=22，P<0.001，而炎性細胞浸潤評分模型組也顯著高于空白組，P<0.01，說明粉刺模型局部出現較強的炎癥反應；基質組與模型組的炎性細胞浸潤程度經卡方檢驗，x2=1.725，P=0.422，且在炎性評分上經統計學比較兩者無顯著性差異（P>0.05）；低劑量組與模型組在炎性細胞浸潤程度上經卡方檢驗，x2=11.511，P=0.009，而局部組織炎性評分相比也顯示出統計學差異P<0.05；中劑量組與模型組的比較時發現中劑量組能顯著改善兔耳炎性等級，經卡方檢驗x2=9.455，P=0.024，且對炎性評分的兩兩比較時發現P<0.01，差異具有顯著統計學意義；高劑量組與模型組炎性程度相比經卡方檢驗x2=9.055，P=0.029，炎性評分比較P<0.05；陽性藥物炎性細胞浸潤程度分級及評分的組間比較，結果發現與模型組經卡方檢驗x2=12.067，P=0.007，炎性評分比較P<0.01。從表中可知，在對兔耳炎性細胞浸潤程度的影響上，中劑量組與陽性藥物組作用相當，均有較強的治療作用，低劑量組與高劑量組也存在治療作用，但效果不如中劑量組與陽性藥物組。

2.3 不同濃度石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳角質層厚度及皮脂腺大小的影響

不同濃度石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳均存在一定的影響，但各組之間差異明顯，模型組與空白組比較皮膚角質層厚度、皮脂腺長短徑出現明顯增厚、增長，差異具有顯著統計學意義（P<0.01），說明粉刺模型兔耳皮膚角質化明顯，皮脂腺出現明顯增生。基質組與模型組比較差異并不明顯，角質層厚度及皮脂腺長短徑經統計學比較（P>0.05），說明石榴皮多酚基質物質對粉刺兔耳皮膚角質化、皮脂腺增生沒有影響。低劑量組、高劑量組與模型組比較皮膚角質層厚度、皮脂腺長短徑明顯降低（P<0.05），但與空白組、中劑量組和陽性藥物組比較明顯增厚（P<0.05），說明高、低劑量的石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳皮膚角質層厚度有一定的改善作用，但作用一般。而中劑量組、陽性藥物與模型組比較，其皮膚角質層厚度、皮脂腺長短徑要顯著低于模型組（P<0.01），說明中劑量石榴皮多酚軟膏在降低皮膚角質層厚度上作用明確，與陽性藥物作用相當。見表2。

2.4 不同濃度石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳毛囊擴張程度的影響

各組大鼠毛囊擴張程度分級及評分結果如表3，在毛囊擴張程度分級上模型組與空白組經卡方檢驗，x2=21.8，P<0.001，而毛囊擴張程度評分模型組也顯著高于空白組（P<0.01），說明粉刺模型局部毛囊擴張明顯；基質組與模型組的毛囊擴張程度經卡方檢驗，x2=1.245，P=0.458，且在毛囊擴張評分上經統計學比較兩者無顯著性差異P>0.05；低劑量組與模型組在毛囊擴張程度上經卡方檢驗，x2=12.313，P=0.007，而局部組織毛囊擴張評分相比也顯示出統計學差異P<0.05；中劑量組與模型組的比較時發現中劑量組能顯著改善兔耳毛囊擴張程度，經卡方檢驗x2=10.232，P=0.032，且對毛囊擴張評分的兩兩比較時發現P<0.01，差異具有顯著統計學意義；高劑量組與模型組毛囊擴張程度相比經卡方檢驗x2=10.036，P=0.031，毛囊擴張評分比較P<0.05；陽性藥物毛囊擴張程度分級及評分的組間比較，結果發現與模型組經卡方檢驗x2=11.027，P=0.008，評分比較P<0.01。從表中可知，在對兔耳毛囊擴張程度的影響上，中劑量組與陽性藥物組作用相當，均有較強的治療作用，低劑量組與高劑量組也存在治療作用，但療效不如中劑量組與陽性藥物組。見表3。

3 討論

痤瘡是多種因素共同導致的皮膚病，痤瘡丙酸桿菌的定殖及炎癥反應、皮脂腺分泌異常增多、毛囊口過度角化等是其發生的最重要的機制[14]。其中，毛囊皮脂腺導管的角化過度是痤瘡發病的基礎，是構成痤瘡病理過程的主要環節之一，由導管角質形成細胞過度增生和導管內皮角化的細胞脫落減少引起[15]。炎癥反應是痤瘡發病機制中的重要組成部分，多種細胞因子作用其中，導致局部炎癥反應和機體對其發生免疫反應[16-17]。由此可知，抗角化和抗炎癥因子是痤瘡治療的重要手段[13]。

歐陽恒教授“以皮治皮”理論認為，在辨病與辨證準確的基礎上選用皮類的藥物治療相關皮膚疾病，常可收到事半功倍的效果[18-19]。例如，根據痤瘡表現出來的粉刺、丘疹、結節、囊腫等病變的不同皮損形態，選用其皮損外形酷似或近似的藥材如石榴皮以治療。且經過本課題組前期研究發現石榴皮治療痤瘡療效突出，因此，進一步探索石榴皮中某種成份是否能有效治療痤瘡具有較大的研究價值。

前期研究發現石榴皮中石榴皮多酚為最主要的活性物質，目前應用廣泛，多個研究報道了石榴皮多酚有降脂、抗菌、抗炎等作用，且通過前期研究也發現了石榴皮多酚能有效抑制痤瘡發病的重要致病菌——痤瘡丙酸桿菌[17]， 因此，本研究從石榴皮多酚外用劑型軟膏入手，通過對兔耳粉刺模型的干預，觀察了不同濃度石榴皮多酚軟膏對兔耳粉刺模型皮膚的抗炎、抗角化作用。通過研究得出低、中、高劑量的石榴皮多酚軟膏均對兔耳粉刺模型有抗角化及抗炎作用，其中中劑量療效最顯著。本研究結果為“以皮治皮”理論提供了一定的實驗依據，也為臨床開發和應用石榴皮多酚軟膏新藥提供了實驗依據。

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