自發性高血壓大鼠左心室肥厚的代謝組學研究

簡維雄 肖隋熙 劉培 羅穎 陳偶英 馮宇 王健章 譚元生

〔摘要〕 目的 以血壓正常的wistar大鼠為對照，研究自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）左心室肥厚心肌組織的小分子產物變化。方法 采用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS），對組織代謝產物進行檢測分析；應用偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）分析差異代謝產物譜。依據變量重要性（VIP）、自變量系數探索SHR發生左心室肥厚心肌時代謝產物。結果 與SHR組呈正相關的是：90角鯊烯、51對苯二甲酸、87麥芽糖、68棕櫚油酸、77葡萄糖-6-磷酸1、8 2-羥基丁酸、78未知、74油酸、56果糖1、28三氰丙氨酸；負相關的是：21琥珀酸、24富馬酸、2丙酮酸、34天門冬氨酸1、85未知、45未知、88甘油單油酸酯、86 油精。結論 進一步證實高血壓導致的左心室肥厚與心肌細胞結構破壞以及能量失衡密切相關。

〔關鍵詞〕 SHR；左心室肥厚；代謝組學

〔中圖分類號〕R544.1；R393 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.001

〔Abstract〕 Objective To investigate the changes of small molecular products in left ventricular hypertrophyof spontaneously hypertensive rats（SHR）， the Wistar rats with normal pressure as the control group. Methods The metabolites were detected by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）， and the differences of metabolite were analyzed by partial least squares （partial least squares discriminant analysis， PLS-DA）. According to the variable importance（VIP） and independent variable coefficients， the left ventricular hypertrophy and myocardial age products in SHR rats were investigated. Results SHR group was positively correlated with： 90 squalene， 51 terephthalic acid， 87 maltose， 68 palmitoleic acid， 77 glucose-6-phosphate 1， 8 2-hydroxybutyric acid， 78 unknown， 74 oleic acid， 56 fructose 1， 28 three cyanogens alanine. Negative related with： 21 succinate， 24 fumarate， 2 pyruvic acid， 34 aspartic acid 1， 85 unknown， 45unknown， 88 glycerol ester of single oil， 86 olein. Conclusion It is further confirmed that the left ventricular hypertrophy induced by hypertension is closely related to the destruction of myocardial cell structure and the imbalance of energy.

〔Keywords〕 SHR； left ventricular hypertrophy； metabonomics

自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是研究高血壓疾病的經典鼠種，研究發現，在第14周齡時，SHR的左心室質量和左心室質量指數已經顯著高于對照組，說明此時左室肥厚已經基本形成[1]。代謝組學是研究關于生物體系（細胞、組織、生物體）受外部刺激或干擾后發生的內源性所有代謝物的定量分析科學。它所關注的是代謝循環中分子量小于1 000的小分子代謝物的變化[2-3]。本項目將進行SHR左心室肥厚的代謝組學研究以期探索其小分子物質變化規律，現將結果報道如下。

1 材料

1.1 動物

選用SPF級12周齡自發性高血壓大鼠（SHR） 8只，雄性，同齡血壓正常的（wistar-kyoto，WKY）大鼠8只，雄性，體質量180～220 g，大鼠及飼料均由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供（SHR大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格許可編號：20141020，飼料購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），飼養環境溫度（20.0±2.0） ℃，相對濕度45% ～70%。自由飲食飲水，早上8點至下午5點自動燈光照明。

1.2 試劑

L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司，中國），BSTFA（含1%TMCS，v/v）（REGIS Technologies. Inc. USA.）

1.3 儀器

Agilent 7890A氣相色譜儀， 美國；LECOChroma TOF PEGASUS HT質譜儀，美國；JXFSTPRP-24研磨儀，中國。

2 方法

2.1 動物分組

8只SHR為模型組，8只照WKY為空白對照組，自由食水喂養2周，密切觀察所有實驗大鼠的精神、飲食、飲水、呼吸、活動力等狀況。處死后立即解剖取心臟標本。

2.2 代謝物萃取

（1）取50 mg心肌樣本于2 mL EP管里，加入0.4 mL甲醇-氯仿（3∶1），再加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸，加入鋼珠，研磨儀（65 Hz）勻漿研磨處理 3 min；（2）4 °C， 12 000 r/min離心15 min；（3）小心地取出350 μL上清于2 mL進樣瓶（甲烷硅基化的）中；（4）質控樣本：每個樣本取約10 μL（根據樣本量而定）于2 mL進樣瓶中，混勻。

2.3 代謝物衍生化

（1）在真空濃縮器中37 °C干燥上述提取物， 大約3.5 h；（2）向干燥后的代謝物加入80 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中80 °C孵育20 min；（3）向每個樣品中迅速加入100 μL BSTFA（含有1% TCMS，v/v），將混合物70 °C孵育1h；（4）冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5 μL FAMEs（飽和脂肪酸甲酯標準混合液，溶于氯仿C8-C16∶1 mg/mL；C18-C24∶0.5 mg/mL）；（5）混勻，上機檢測。

2.4 上機檢測

Agilent 7890氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀配有Restek Rxi-5Sil MS毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）， Restek，USA。GC-TOF-MS具體分析條件如下，進樣量：1 μL，不分流模式；載氣：氦氣；前進樣口吹掃流速：3 mL/min；柱流速：1 mL/min；柱溫：60 °C保持1 min，以10 °C每分鐘的速率上升至330 °C，保持10 min；前進樣口溫度：280 °C；傳輸線溫度：280 °C；離子源溫度：220 °C；電離電壓：-70eV；掃描方式：85～600 m/z；掃描速率：20 spectra/sec；溶劑延遲：366 s。

2.5 統計學處理

根據GC-MS總離子流圖中各峰的保留時間挑選共有峰（各圖譜中共有的色譜峰），獲取各峰與內標峰的峰面積數據，用相對峰面積（與內標峰的比值）表示代謝物的含量。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）應用SIMCA-2P 11.5軟件。

3 結果與分析

3.1 總離子流圖

大鼠組織GC-MS分析總離子流圖如圖1所示。

3.2 代謝物鑒定

共有峰挑選后發現組織中共有內源性代謝物93種，利用NIST質譜數據庫對共有的內源性代謝物作鑒定，以通常匹配度大于700的鑒定結果作為較為可信的物質。見表1。

3.3 兩組大鼠心肌組織PLS-DA

將血漿93種代謝產物通過主成分分析，進行SHR組、WKY組2組模式識別（圖2）。結果顯示：SHR組在得分圖左下方主要在第三象限，WKY組在右側偏上方主要在第一象限；SHR與WKY組呈現出良好的分離。因子載荷圖顯示（圖3）：與SHR相關的變量集中在第三象限比如：87、9、43、51、77、78、65、56、74。與WKY相關的變量集中在第一、四象限比如：24、34、85、86、75、21、93、2、88。

自變量VIP（>1.2）系數圖顯示（圖4）：引起組別差異的自變量依據重要性排序的是90角鯊烯、51對苯二甲酸、87麥芽糖、21琥珀酸、68棕櫚油酸、77葡萄糖-6-磷酸1、8 2-羥基丁酸、24富馬酸、74油酸、2丙酮酸、78未知、45未知、85未知、34天門冬氨酸1、56果糖1、88甘油單油酸酯、862油精、28三氰丙氨酸。

SHR組與WKY組兩組間自變量系數圖顯示（圖5）：與SHR組呈正相關的系數是：90角鯊烯、51對苯二甲酸、87麥芽糖、68棕櫚油酸、77葡萄糖-6-磷酸1、8 2-羥基丁酸、78未知、74油酸、56果糖1、28三氰丙氨酸。負相關的是：21琥珀酸、24富馬酸、2丙酮酸、34天門冬氨酸1、85未知、45未知、88甘油單油酸酯、86油精（圖4，5橫坐標為代謝產物ID，縱坐標為變量系數）。

4 討論

4.1 代謝產物變化趨勢分析

PLS結果發現與在SHR組水平上調的物質有：90角鯊烯、51對苯二甲酸、87麥芽糖、68棕櫚油酸、77葡萄糖-6-磷酸1、8 2-羥基丁酸、78未知、74油酸、56果糖1、28三氰丙氨酸。水平下調的物質有：21琥珀酸、24富馬酸、2丙酮酸、34天門冬氨酸1、85未知、45未知、88甘油單油酸酯、86油精。初步閱讀代謝產物，從已鑒定的物質分析主要涉及脂肪酸與氨基酸、糖類，綜合分析主要涉及能量代謝，為此本文從能量代謝的角度分析了心肌肥厚。在心肌肥大的發生和進程中，由于負荷性心肌能量需求增加，以及能量的相對不足，導致心肌細胞的產能機構也出現明顯的適應性改變，正常心肌以線粒體中進行的脂肪酸酸β氧化（FAO）做為主要能量來源，而葡萄糖氧化在心肌能量供應中所起作用較小。在心肌病理性肥厚時，胚胎型的肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶同工酶的含量及活性均有明顯提高，肥厚心肌細胞能量來源發生改變，從脂肪氧化過度到葡萄糖氧化，同時代謝途徑從有氧氧化向無氧酵解轉化[4]。心肌細胞中脂肪酸β氧化減少，游離脂肪酸（FFA）增加。這種轉變能夠在消耗同樣氧氣的條件下產生更多的ATP，可能是對心肌肥厚時缺血缺氧的一種適應性變化。但長期以糖為氧化底物會引起游離脂肪酸在心肌細胞內積聚，對細胞膜和膜結合蛋白活性產生損害，同時引發能量利用障礙。因此心肌脂肪酸、糖原氧化障礙可能參與了心肌肥厚的形成與維持[5]。

在水平上調的物質中角鯊烯是一種參與多種生化反應、具有多功能的生物活性物質，是固醇生物合成重要的前體物質，作為細胞膜結構的組分是機體內不可或缺的生命物質。這有可能是心肌細胞肥大時細胞膜的損傷，可以導致角鯊烯水平上調。角鯊烯具有抗脂質過氧化功能，同時還具有加快超氧化酶和乳酸脫氧酶活力，增強吸收氧的能力，從而加快乳酸分解，強化能量代謝的作用[6]。心肌肥厚時角鯊烯抗脂質過氧化功能顯然影響心肌細胞的脂質氧化，起保護作用。而乳酸分解的過程是可以給相對能量不足的心肌帶來更多的ATP，但這有可能會加重脂肪酸酸類物質在細胞內的堆積，加重心肌的損傷。

苯二甲酸（TPA）是世界上廣泛使用的一種化學物，被廣泛用于合成樹脂、薄膜、聚醋纖維等，還可用于紡織品中的堿化劑以及家禽的飼料添加劑。SHR體內對苯二甲酸水平上調是否與苯基脂肪酸分解相關，具體機制有待進一步探討。

麥芽糖是由2分子葡萄糖通過α-1，4糖苷鍵連接而成的雙糖，由麥芽糖酶水解成2分子葡萄糖，參加三羧酸循環代謝后為機體提供能量。體內不能合成麥芽糖，多是經飲食后進入組織細胞，在麥芽糖酶的作用下轉化成葡萄糖。組織內麥芽糖水平的上調，考慮是麥芽糖酶的缺乏。麥芽糖酶缺乏的原因可能與心肌細胞肥大后喪失部分細胞功能有關，而糖原的增加導致在溶酶體和細胞漿內大量積聚，進一步加重細胞損傷[7]。

己有實驗證實在SHR（15周齡，中度心肌肥厚）中，發現葡萄糖氧化能力增強，而脂肪酸氧化受抑，導致其聚集在細胞內，能量底物從長鏈脂肪酸β氧化為主轉向以糖類氧化為主[8]。脂肪酸β-氧化也是脂肪酸的改造過程，機體所需要的脂肪酸鏈的長短不同，通過β-氧化可將長鏈脂肪酸改造成長度適宜的脂肪酸，供機體代謝所需，比如油酸、棕櫚油酸。

油酸是一種單不飽和脂肪酸，人體血液內的油酸分為外源性油酸和內源性油酸。外源性的油酸從飲食中獲得， 內源性的油酸是通過硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）生成的。SCD可以將棕櫚酸和硬脂酸化生成棕櫚油酸和油酸，這些脂肪酸是膜磷脂、甘油三酯、膽固醇酯等的必需組成部分[9]。棕櫚油酸是十六碳不飽和脂肪酸磷脂水解的產物，還是前列腺素、白細胞三烯、血栓烷的前體物質。在SHR中油酸、棕櫚油酸水平增高考慮是細胞膜在各種因素作用下損傷導致[10-11]以及脂肪酸β氧化的結果。但也不能排除是SCD的作用，SCD是催化單不飽和脂肪酸的限速酶，目前其調節機制尚不明確，但有證據表明葡萄糖、果糖可以誘導SCD活性[12]。

葡萄糖-6-磷酸不僅是糖酵解途徑的第一個產物，也是磷酸戊糖途徑的起始底物，除此之外它也是糖異生途徑的中間產物葡萄糖-6-磷酸由葡萄糖經過葡萄糖激酶催化并消耗ATP得來，這步反應因為是不可逆反應且消耗ATP，所以是糖酵解途徑中的關鍵限速反應。在肥厚的心肌中糖酵解活性增強，更多的選擇葡糖糖、而不是脂肪酸，這就使得葡萄糖激酶活性增強，葡萄糖-6-磷酸水平增高。而葡萄糖激酶活性增強極有可能促進蛋白激酶C，從而進一步促使心肌肥厚的進展[13-15]。

2-羥基丁酸可在乳酸脫氫酶的作用下由α-丁酮酸形成。而α-丁酮酸是蘇氨酸的降解產物之一，由蘇氨酸脫氨酶脫氨而來；可以是胱硫醚由高半胱氨酸和絲氨酸通過胱硫醚β-合成酶（CBS）合成，再由胱硫醚γ-裂解酶（CSE）裂解為半胱氨酸和α-丁酮酸[16]。雖然已有的研究證實在高血壓疾病時CBS/CSE呈現出低表達，但考慮已有針對CBS/CSE的研究報告多是從血管內皮系統出發，心肌組織的表達尚未見報道。有研究表明高血壓心肌組織中半胱氨酸的高表達，可以推測在組織中CBS/CSE可能呈現出高表達，導致α-丁酮酸生成，在已經激動的乳酸脫氫酶作用生成2-羥基丁酸。

果糖是左旋性的六碳酮糖，是葡萄糖的同分異構體，己糖激酶在ATP的作用下轉化為1-磷酸果糖，然后進一步代謝為甘油醛、磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛，從而進入與葡萄糖代謝過程。但是心肌肥大后細胞內導致ATP相對缺乏，而己糖激酶對葡萄糖的親和力比對果糖的親和力高12倍，隨著能量代謝向葡萄糖氧化轉移，為此導致果糖蓄積，與麥芽糖相同，蓄積在細胞內則會導致損傷的發生。

用于產能的底物明顯下降，三羧酸循環的正常功能將受到抑制。這可能與三羧酸循環酶的功能損傷有密切關系。三羧酸循環（TCA cycle）是有氧代謝的主要途徑，普遍存在于需氧生物體內，包括高等動植物及低等的細菌、微生物的線粒體內。線粒體在細胞內與細胞骨架通常形成一個復雜的三維分支結構，與細胞骨架的關系決定著線粒體的形狀，從而影響其功能。因為心肌細胞的肥大可以導致細胞骨架的改變，同時肥大后各種損傷因素都可以導致線粒體功能的的損傷。功能的損傷必定導致三羧酸循環的底物水平的下調，琥珀酸、富馬酸、草酰乙酸是循環底物，正如此才導致琥珀酸、富馬酸水平下調。天冬氨酸是一種α-氨基酸，由草酰乙酸發生氧化脫羧生成丙酮酸。故天冬氨酸、丙酮酸水平也呈現下調。

2-甘油單油酸酯與甘油單油酸酯在細胞中可以由L-α-磷酸甘油和脂酰輔酶A合成，L-α-磷酸甘油來源有兩個，一個是肝臟中在甘油激酶的催化下由甘油與ATP合成。但心肌組織中顯然是第二種來源，磷酸二羥基丙酮在α-甘油磷酸脫氫酶作用下以NADH為輔酶還原而成，這其中的磷酸二羥基丙酮是糖酵解中縮醛酶的產物，在心肌肥厚細胞三羧酸循環功能障礙下，這種產物可能不足，為此2-甘油單油酸酯與甘油單油酸酯水平呈現下調。

4.2 結論

本研究進一步證實了心肌細胞結構破壞后的能量轉化以及能量失衡理論。高血壓左心室肥厚，是心肌細胞肥大，細胞間質增生的結果。心肌細胞肥大，失去了其原來固有的組織構架，可以表現在細胞膜、線粒體膜的破壞在磷脂分解后可以導致角鯊烯、棕櫚油酸這一類物質水平的上調。細胞失去原固有組織構架必然會導致其某些功能的失衡，可以導致麥芽糖激酶減少，麥芽糖分解減少，水平上調。心肌細胞的肥大，導致細胞內相對缺氧，在這種條件下，細胞氧化途徑發生改變，由脂肪酸β氧化轉移至糖氧化，這將直接導致進入細胞內的脂肪酸堆積油酸、棕櫚油酸水平上調。葡萄糖氧化途徑增強可導致葡萄糖-6-磷酸水平上調，這個過程中在激活的酶如氨酸脫氫酶作用下2-羥基丁酸水平上調。由于葡萄糖激酶的競爭力要強于果糖激酶，這將導致果糖堆積細胞內，這個過程也是缺氧的。三羧酸循環功能在細胞器結構受損的基礎之上，進一步受到影響。故三羧酸循環底物以及其附屬產物呈低水平狀態，體現在琥珀酸、富馬酸、丙氨酸、天冬氨酸。

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