新型造模法制備功能性消化不良肝郁脾虛證大鼠模型

朱潔 王葉 郭璇 劉樂平 韓志飛

〔摘要〕 目的 從病因胃排空延緩、內臟高敏性、心理因素等入手改良建立新的功能性消化不良肝郁脾虛證動物模型。方法 將SD大鼠隨機分為5組：高脂組（A組）、大黃組（B組）、復合組（C組）、夾尾對照組（D組）、 空白對照組（E組）。除空白對照組，其余4組以束縛和游泳為基礎，在A組加入可以導致胃排空延緩的高脂，在B組加入可以導致脾虛的苦寒瀉下藥大黃煎劑，并將A、B進行結合形成復合組（C組），而D組是國內常用的造模方法即夾尾刺激法，且以D組作為對照，通過觀察行為學狀態，檢測胃排空率、小腸推進率對造模結果進行評價。結果 造模結束后，A、B、C、D組大鼠均出現扎堆、靠邊， 活躍度降低， 攻擊性減少， 易受驚嚇且易怒，毛發枯亂無光澤， 糞便變軟等表現；與E組相比，其他4組造模組的胃排空率和小腸推進率均有降低，C、D組降低顯著，差異具有統計學意義（P<0.01）。結論 選用復合組的造模方法可以使大鼠出現一系列的肝郁脾虛癥狀，并且有效地降低大鼠的胃排空率和小腸推進率。

〔關鍵詞〕 功能性消化不良；肝郁脾虛證；動物模型

〔中圖分類號〕R285.5；R965.1；R57 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.002

〔Abstract〕 Objective From the delay of gastric emptying， visceral hypersensitivity， psychological factors and other causes to improve the establishment of a new animal model of dyspepsia rats with liver depression and spleen deficiency syndrome. Methods The SD rats were randomly divided into five groups： high fat group （group A）， rhubarb group （group B）， combination group （group C）， clip tail control group （group D）， blank control group （group E）. Except for the blank control group （group E）， the remaining four groups were given the basis training of restraint and swimming. In group A， the high fat caused delay of gastric emptying was added. In group B， bitter cold diarrhea decoction caused spleen deficiency was added， and group C was formed by combination of group A and group B. Group D as a control group was given a commonly used modeling method of tailgating stimulation. The modeling results were evaluated by observing behavioral status， gastric emptying rate， small intestine propulsion rate. Results After modeling， rats in group A， B， C and D appeared the behavior of getting together， keeping to the side， decreased activity， reduced aggression， vulnerable to scared and irritable， hair dull and dull， and soft stool. Compared with group E， the gastric empting rate and small intestine advance rate in other four groups decreased， and the decrease degree in group C and D was more obvious， the differences were statistically significant （P<0.01）. Conclusion The compounding method could make rats appear a series of symptoms of liver depression and spleen deficiency， and effectively reduce the gastric emptying rate and intestinal propulsion rate in rats.

〔Keywords〕 functional dyspepsia； liver depression and spleen deficiency； animal models

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是一種常見的功能性胃腸病，且尚無器質性原因可究，在全球范圍內總患病率約為11.5%～14.5%[1]，在流行病學調查顯示國內功能性消化不良的患病率為23.5%[2]。臨床表現主要為食欲不振、腹脹、腹痛、早飽、噯氣、惡心嘔吐等，其發病機制尚未完全闡明，目前以胃容受性受損、內臟敏感性增高、胃腸動力障礙為主要病理生理改變[3]。功能性消化不良動物模型是進行功能性消化不良相關研究的重要基礎，目前國內外已建立多種FD動物模型，常用的有郭氏夾尾應激法[4]即用夾鼠尾的方法來激怒大鼠；碘乙酰胺灌胃法則是根據炎癥后內臟敏感性增高的機制設計的，剛剛出生10 d的大鼠用0.1%的碘乙酰胺蔗糖溶液進行灌胃，等到大鼠成熟期即可成為功能性消化不良大鼠模型[5]等單因素造模方法；也有復合因素造模方法，碘乙酰胺聯合夾尾刺激造模[6]；如韓秋艷等用慢性夾尾激怒加高濃度大黃灌胃法造模[7]。但是單因素造模法存在刺激因素過于單一，存在與臨床實際情況相差太大的問題，而復合因素的造模方法則能夠更為全面地模擬FD發病因素的多樣化、復雜化。研究人員從功能性消化不良的主要病因即胃排空延緩、內臟高敏感、肝郁脾虛以及外邪致病（如飲食不節、藥物所傷）入手，將已有的造模方法進行組合改良，建立復合因素動物模型，試圖探索出一種在造模過程中能降低動物死亡率、更貼近自然發病情況的造模方法，為功能性消化不良的造模提供更好的思路及方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SD大鼠，SPF級，雌性，體質量180～220 g，許可證號：SCXK（湘）20110003，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

1.1.2 藥物制備 生大黃（湖南中醫藥大學第一附屬醫院）、碘酒、高脂飼料（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）[8]；生大黃，煎煮，濃縮成0.5 g/mL，備用。高脂飼料：84%玉米粉+15.5%豬油+0.5%膽固醇。半固體糊：取5 g羧甲基纖維素溶于100 mL蒸餾水中，分別加入奶粉8 g，糖4 g，淀粉4 g，2 mL碳素墨水，配成半固體糊[9]，置冰箱中冷藏保存，臨用前兩小時取出恢復至常溫。

1.1.3 主要器材 自制束縛架、夾尾器；AR2140電子天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將30只大鼠適應性喂養1周后，隨機編號分組，即分為高脂組（A）、大黃組（B）、復合組（C）、夾尾對照組（D）及空白對照組（E）。空白對照組正常喂養，其余四組均進行束縛和游泳，每天早8：00-11：00將大鼠束縛于束縛架[10]上進行固定，放入飼養箱中，每日3 h，連續21 d；另實驗大鼠于每日14：00游泳12 min，持續3周。在上述造模方法基礎上在A組大鼠食用高脂飼料2周；B組采用灌胃的方式給予大黃煎劑10 g/（kg·d）連續給藥14 d；C組的造模方法為大黃煎劑+高脂飼料喂養+束縛+游泳；D組為國內較常用夾尾刺激法，將該組3只大鼠同籠，用長海綿鉗夾大鼠尾巴遠端1/3處，以不破皮為度，令其暴怒，尋釁與其他大鼠撕打，以激怒全籠大鼠。每次刺激30 min，每日1次，連續刺激21 d。1.2.2 行為學狀態觀察 實驗過程中通過肉眼觀察大鼠的皮膚毛發、行為狀態、活躍程度、情緒反應、興奮程度、睡眠狀態及大便狀態，記錄大鼠的體質量變化。

1.2.3 胃腸動力檢測 （1）胃排空率的測定：造模結束后禁食不禁水24 h，給予半固體糊2 mL灌胃[9]，30 min后處死，迅速打開腹腔，剪取胃及全小腸，由吸水紙吸干胃外壁，稱取質量后沿胃大彎剪開，用生理鹽水沖洗，再吸干水分后稱量，胃排空率=1-[（胃全重-胃凈重）/灌胃量]×100%；（2）小腸推進率的測定：分離腸系膜， 剪取幽門至回盲部的腸管[11]， 置于白紙上， 輕輕拉成直線， 測量腸管長度為小腸總長度， 從幽門至碳墨前沿的距離為碳墨在小腸內推進的距離。小腸推進率=碳墨在小腸推進的距離/小腸總長度×100%[11]。

1.3 統計方法

統計學處理實驗所有數據用“x±s”表示， 均用SPSS 17.0軟件處理， 滿足方差齊性采用單因素方差分析，反之則使用非參數檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態

實驗期間空白對照組無異常情況，隨著造模時間的增加，四組模型組均出現皮膚毛發干枯少澤，少動扎堆，活躍度降低，情緒反應大、易怒或對外界刺激反應較少興奮，淡漠，體質量減輕，倦怠嗜睡，便溏，肛門污穢等肝郁脾虛之相似癥狀。

造模第21天時，四組模型組大鼠體質量與空白組相比雖有下降，但差異無統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 胃腸動力檢測

A、C、D三組胃排空率低于空白對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）；B組胃排空率雖有下降，但差異不具有統計學意義（P>0.05）；A、B組小腸推進率低于空白對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）；C、D組小腸推進率低于空白對照組，差異具有統計學意義（P<0.01）；C、D組相比，沒有顯著差異性，不具有統計學意義（P>0.05）。實驗結果顯示，復合組大鼠的胃排空率和小腸推進率降低顯著，從胃腸動力障礙這個角度看采用新型造模方法可以有效制備肝郁脾虛證動物模型，且實驗中選用的復合因素造模法在理論上可以較全面地模擬FD患者的復雜發病機制及臨床表現。見表2。因此可以認為進一步開發新型造模方法是必要且有意義的。

2.3 動物死亡率情況統計

在實驗過程中，實驗人員嚴格參照實驗步驟與要求進行實驗操作，盡量減少因實驗技術造成的死亡，在此條件下，夾尾組出現1例死亡，經分析，可能與長期接受夾尾刺激，在飲食飲水減少，便溏等情況下造成免疫力降低有關，而其余模型組在實驗過程中均未出現死亡。

3 討論

中醫學運用五行學說解釋臟腑的生理及相互關系，曰肝屬木，主疏泄，脾屬土，為氣血生化之源，五行相克理論說明肝木克脾土。隨著中醫學的發展，衍生出“顛倒五行”學說以便于更加合理的解釋五臟之間的相互作用，由此可知土亦克木，清·程芝田也曾提到“木可克土，土也可克木，脾土健旺則肝木自平也”。肝與脾之間相互制約、相互依賴的關系稱為肝脾調和，高月香等指出若肝脾任何一方偏盛偏衰，則出現肝脾不調[12]，而肝郁脾虛證的病機便在于肝脾不調。在西醫學研究中FD是一種常見的功能性胃腸病，且尚無器質性原因可究。

胃排空延緩是造成FD的重要發病機制之一，早期的Meta分析納入了17項研究包含868名FD患者和397例對照，結果顯示40%的FD患者存在胃排空的延緩[13]；近年來隨著人們工作生活壓力的增大，發病率逐漸增高，臨床表現主要為食欲不振、腹脹、腹痛、早飽、噯氣、惡心嘔吐等[14]，歐洲的相關研究認為餐后不適、惡心、嘔吐的癥狀與胃排空延緩相關[15]；Tack等對連續入組的800例FD患者的研究發現：胃排空功能障礙與早飽、惡心、嘔吐及飽脹感相關。由此表明胃排空延緩可能與功能性消化不良有一定的關系[16]。長期的高脂飼料喂養能夠上調位于胃腸道的nNOS以及TGR5的表達，影響非腎上腺能非膽堿能，最終造成胃排空延緩[8]；相關研究顯示高脂飼料可以造成大鼠胃腸動力異常，如胃排空率的降低、胃節律的障礙等[17]；但是食用高脂飼料的大鼠血脂變化有一定的影響，給實驗增添了不確定因素[18]，且長期喂養高脂飼料導致胃排空延緩的機制尚未清晰，有待進一步的研究。大黃性味苦寒，有“傷元氣，耗陰血，損脾胃以致虛的性質”，其作用于健康機體的主要病理改變為損傷正氣，會出現耗傷津液，丟失離子，降低體溫，減緩代謝等不良反應[19]。基于現有研究現狀，高脂是造成胃排空延緩的有效方法，而大黃是脾虛證造模的經典方法，但將兩者結合進行造模卻不曾見，本實驗將這兩者有機結合，以期制備出合理有效的動物模型。

本實驗中A、B、C、D四組均能有效降低大鼠小腸推進率，其差異具有統計學意義，但A、B組對大鼠小腸推進率降低的影響不及C、D組，C、D組降低胃排空率效果明顯，而A、B組不明顯。通過對大鼠的胃排空率檢測與行為狀態學觀察發現，在所有實驗組中，C組對大鼠胃排空率以及小腸推進率影響最大，其一般狀態也更接近于FD的臨床特征。實驗結果證明，C組復合組作為本實驗創新的造模方法，該法不但能夠有效造出FD模型，并且具有一定優勢。高脂與大黃的組合不僅實現了多種致病因素的結合，還有效地實現了中西醫的有機結合，與夾尾組相比，減少了對實驗人員造成傷害的可能性，降低了大鼠死亡率，實驗過程中該組無大鼠死亡；與其他各組相比，該組多種單一因素的結合與該病臨床發病機制更為切合。但本實驗依然存在一定的缺陷，實驗中對FD模型大鼠胃收縮頻率、胃內壓、胃電圖以及其它胃腸激素的影響均未涉及，有待于進一步的深入研究。本文認為實驗造模方法更側重于造成大鼠脾虛證，對大鼠肝郁證卻有所忽略；功能性消化不良肝郁脾虛證的發病率逐漸增高，生理因素作為其主要因素值得深究，但心理因素對該病也有著了不可忽略的影響。臨床實踐發現，心理壓力大、心情抑郁確實是造成機體發病不可忽視的因素，且精神心理因素既是致病因素，同時FD患者病情反復發作也會加重患者的抑郁情緒。在FD患者與正常人的心理調查中發現FD患者多伴有抑郁焦慮等負面情緒，FD患者的心理健康水平顯著低于正常人[20]。部分學者針對FD患者采用抗抑郁藥物治療，能有效改善臨床癥狀，也提示心理因素在FD的發病機制種占據重要地位[21]。《內經》中也有提及：“怒傷肝，久則郁……病多發于肝，三日而之脾”，肝郁則橫逆犯脾，脾失健運。由此看來，FD與情志抑郁心理因素密切相關。基于前文所述，筆者認為實驗有待進一步的研究改進。

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