酸奶發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量的分析

王全利　何四云　賀習(xí)耀　鄒智

摘要：酸奶的氨基酸含量與其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味及質(zhì)構(gòu)密切相關(guān)。試驗(yàn)研究了酸奶發(fā)酵過(guò)程中各種游離氨基酸含量的變化。結(jié)果表明，在40 ℃恒溫發(fā)酵10 h的過(guò)程中，酸奶的總游離氨基酸含量先降后升，發(fā)酵0～8 h以乳酸菌分解游離氨基酸占主導(dǎo)地位，8～10 h以蛋白質(zhì)水解占主導(dǎo)地位。谷氨酸、組氨酸、蛋氨酸、兩種芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）和支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)且在0～4 h時(shí)下降幅度為極顯著；而牛磺酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和賴氨酸含量在4～8 h時(shí)下降幅度為極顯著；而精氨酸和天冬氨酸含量在整個(gè)發(fā)酵期間呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。另外通過(guò)主成分分析發(fā)現(xiàn)40 ℃發(fā)酵10 h酸奶游離氨基酸水平進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的階段，結(jié)合pH檢測(cè)及感官評(píng)定，選擇10 h作為其發(fā)酵終點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：酸奶；發(fā)酵；乳酸菌；游離氨基酸

中圖分類號(hào)：TS252.41 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）13-3137-04

Change of Free Amino Acids in Fermentation of Yoghourt

WANG Quan-lia，HE Si-yunb，HE Xi-yaob，ZOU Zhia

（a. Dean′s Office； b. College of Culinary and Food Technology， Wuhan Business University， Wuhan 430056， China）

Abstract： The amino acids in yoghourt closely related with the nutrition， flavor and texture were analyzed during yoghourt fermentation process. The resuls showed that the contents of total free amino acids first decreased and then increased during the 10 h fermentation under 40 ℃. During the fermentation from 0 to 8 hours， the catabolism reaction by lactic acid bacteria played a dominant role while during the 8 h to 10 h the total free amino acids increased mainly because the hydroxylation of casein and polypeptide. The contents of glutamate， histamine， methionine， two kinds of aromatic amino acid and branched-chain amino acids continuously decreased especially during 0 to 4 hours while the contents of taurine， alanine， glycine， threonine， serine and lysine reduced sharply during 4 to 8 hours. The level of arginine and asparate continuously increased in the process. Results of the principal component analysis showed that the contents of free amino acids in yoghourt reached relatively stable level when it was fermented under 40 ℃ after 10 hours taken as the end of fermentation by pH test and sensory evaluation.

Key words： yoghourt； fermention；lactic acid bacteria； free amino acids

酸奶是以乳和乳制品為原料，通過(guò)添加發(fā)酵劑產(chǎn)生大量乳酸的一種發(fā)酵乳制品。酸奶發(fā)酵劑一般為保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），人們常將它們稱之為乳酸菌（lactic acid bacteria）[1，2]。經(jīng)過(guò)乳酸菌的發(fā)酵，牛奶中大量的酪蛋白和乳清蛋白轉(zhuǎn)化為更易吸收的多肽和氨基酸。酸奶中氨基酸不僅有益腸道健康[3]，可提高機(jī)體免疫功能[2]，還能通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶的作用形成α酮酸類物質(zhì)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為醛、醇和酯類風(fēng)味物質(zhì)[4]；此外酸性氨基酸可影響酸奶pH，有助于凝膠結(jié)構(gòu)的形成[5]。總之酸奶中氨基酸的含量與酸奶的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)特點(diǎn)密切相關(guān)。目前關(guān)于酸奶制作過(guò)程中氨基酸含量變化的報(bào)道尚不多見(jiàn)[6]。本試驗(yàn)采用氨基酸分析儀動(dòng)態(tài)分析了酸奶發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量的變化，旨在為進(jìn)一步研究酸奶的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

光明優(yōu)倍高品質(zhì)鮮牛奶（蛋白質(zhì)含量約3.4 g/100 mL），伊仕特酸奶發(fā)酵劑（包括嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌和羅伊仕乳桿菌），白砂糖，均為食品級(jí)。

1.2 儀器

小熊酸奶機(jī)、酸度計(jì)、氨基酸自動(dòng)分析儀（L-8800型）。

1.3 方法

1.3.1 酸奶制作工藝及操作要點(diǎn) 在室溫條件下，取鮮奶1 L，加入1 g酸奶發(fā)酵劑和65 g白砂糖，充分混合均勻。將混合物放入酸奶機(jī)內(nèi)，（40±1） ℃恒溫發(fā)酵12 h。發(fā)酵過(guò)程均為密閉條件，且采用溫度計(jì)監(jiān)控發(fā)酵溫度。

1.3.2 取樣與保存 從牛奶混合物溫度達(dá)40 ℃時(shí)開(kāi)機(jī)計(jì)時(shí)，分別在試驗(yàn)0、1、2、4、6、8、10、12 h時(shí)取樣，樣品置于冰水混合物中，降溫后0 ℃凍存。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行。

1.3.3 樣品分析 每個(gè)樣品使用pH計(jì)檢測(cè)其pH，作為其發(fā)酵程度的控制標(biāo)準(zhǔn)。樣品中游離氨基酸分析參照GB/T5009 124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SIMCA-P對(duì)酸奶發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的氨基酸含量進(jìn)行主成分分析。應(yīng)用EXCEL和SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。氨基酸含量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)顯著性分析采用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶制作過(guò)程中pH的變化

在酸奶40 ℃恒溫發(fā)酵過(guò)程中，酸奶pH隨時(shí)間變化的趨勢(shì)如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，在酸奶發(fā)酵初期（0～2 h），其pH變化趨勢(shì)較為緩和，原因可能在于此時(shí)各種菌株尚未充分活化，發(fā)酵過(guò)程處于初始階段，并且牛奶中天然包含的緩沖體系也發(fā)揮了一定作用。在發(fā)酵4～8 h時(shí)，后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)與前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的pH具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，pH由6.3下降為5.7。而在發(fā)酵后期（10～12 h），酸奶pH變化再次趨緩。在白砂糖含量為65 g/L的條件下，結(jié)合感官評(píng)定后認(rèn)為發(fā)酵10 h時(shí)酸度較為合適，而12 h時(shí)酸度略微強(qiáng)烈?？紤]到酸奶發(fā)酵后4 ℃儲(chǔ)存時(shí)發(fā)生的后發(fā)酵過(guò)程，為避免酸奶過(guò)酸，最終選擇發(fā)酵10 h 作為試驗(yàn)終點(diǎn)。

酸奶在發(fā)酵過(guò)程中口感變酸、pH下降主要是由于乳酸菌代謝乳糖生成乳酸所致。乳糖在β-半乳糖糖苷酶的作用下分解為半乳糖和葡萄糖，葡萄糖經(jīng)過(guò)糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸，此過(guò)程中己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是其限速酶。此外乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的甲酸及各種酸性氨基酸對(duì)酸奶pH的下降也有部分影響。

2.2 酸奶制作過(guò)程中氨基酸含量的主成分分析

主成分分析法是采用數(shù)據(jù)降維的方法，將多維矩陣數(shù)據(jù)重新組合成一組新的相互無(wú)關(guān)的幾個(gè)綜合變量，同時(shí)根據(jù)方差大小抽取綜合變量，盡可能多地保持原來(lái)變量信息的統(tǒng)計(jì)方法。在主成分分析的得分圖（圖2）中，可見(jiàn)試驗(yàn)0 h的3個(gè)樣本和試驗(yàn)4 h的樣本距離較遠(yuǎn)，表明試驗(yàn)0 h和4 h的各種氨基酸含量總體差別較大；而試驗(yàn)8 h和10 h的樣本分布集中，即試驗(yàn)8 h和10 h時(shí)酸奶氨基酸總體變化較小。這表明試驗(yàn)8～10 h，發(fā)酵酸奶的氨基酸含量進(jìn)入一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。

2.3 酸奶制作過(guò)程中氨基酸含量的變化

蛋白質(zhì)水解生成為多肽，再將多肽轉(zhuǎn)化為游離氨基酸加以利用，這是乳酸菌最重要的代謝活動(dòng)之一。目前至少16種由乳酸菌產(chǎn)生的多肽已經(jīng)被確認(rèn)[1]。許多游離氨基酸的代謝也已被闡明。然而還有一些氨基酸及多肽的代謝有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中（圖3）總游離氨基酸（TFAA）含量在0～8 h持續(xù)下降，而在8～10 h含量略有上升，這表明在40 ℃恒溫發(fā)酵的過(guò)程中，蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸的過(guò)程和乳酸菌進(jìn)一步分解利用游離氨基酸的過(guò)程同時(shí)存在，且0～8 h時(shí)乳酸菌的分解占主導(dǎo)地位，之后蛋白質(zhì)水解占主導(dǎo)地位。必需游離氨基酸（EFAA）隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì)。

在發(fā)酵開(kāi)始（0 h）時(shí)，牛奶游離氨基酸中牛磺酸含量最高，達(dá)到了16.7 g/L（圖4 C），其次是谷氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。不同動(dòng)物的母乳中其游離氨基酸的組成模式并不完全相同，可能與小動(dòng)物哺乳期的不同營(yíng)養(yǎng)需求相關(guān)。一般而言，?；撬崾切∈?、貓、狗和猴子母乳中含量最多的氨基酸，但是對(duì)兔、牛、馬而言，?；撬岷坎⒉皇呛芨遊7]。本試驗(yàn)牛奶中含量最高的?；撬醽?lái)源尚不清楚。另外牛奶中氨基酸的含量還與奶牛的生理狀況密切相關(guān)，一般認(rèn)為在泌乳期29 d之后，谷氨酸及谷氨酸鹽成為牛奶中含量最為豐富的氨基酸[7]。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)牛奶游離氨基酸中幾乎不含有精氨酸，只含有少量的鳥(niǎo)氨酸和色氨酸。

由圖4 A、圖4 B可見(jiàn)，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和組氨酸含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在0～4 h時(shí)氨基酸含量下降最為迅速。其中谷氨酸在乳酸菌脫羧酶的作用下可生成γ-氨基丁酸，試驗(yàn)4～8 h時(shí)，谷氨酸含量下降而γ-氨基丁酸呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這表明試驗(yàn)4～8 h時(shí)谷氨酸的分解反應(yīng)可能被激活。芳香族氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中持續(xù)下降，文獻(xiàn)[4]表明其在氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下分解，產(chǎn)生的代謝物具有花香，與酸奶風(fēng)味密切相關(guān)。同為芳香族氨基酸的色氨酸在試驗(yàn)4～8 h含量顯著升高，其原因有待進(jìn)一步研究。支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）含量也隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)降低，其原因很可能是其通過(guò)氨基轉(zhuǎn)移酶代謝為酮酸類物質(zhì)，最終轉(zhuǎn)化為醛、醇及脂肪酸類物質(zhì)，可以產(chǎn)生麥芽、水果及甜香味[4]。

由圖4C、圖4D可見(jiàn)，?；撬?、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸及賴氨酸含量在0～4 h時(shí)或者下降或者上升，但是在4～8 h時(shí)下降極為顯著，之后（8～10 h）除丙氨酸含量略有上升和絲氨酸含量下降外，其他氨基酸含量基本維持穩(wěn)定。

由圖4 E可見(jiàn)，精氨酸和天冬氨酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)升高，這表明蛋白多肽水解產(chǎn)生精氨酸和天冬氨酸的分解過(guò)程占主導(dǎo)地位。精氨酸還可以在精氨酸脫亞氨（Argininedeiminase，ADI）的作用下轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，進(jìn)一步分解為鳥(niǎo)氨酸，且通過(guò)底物水平磷酸化供能并釋放出游離氨。而鳥(niǎo)氨酸含量降低，表明精氨酸的分解代謝受到抑制。同樣地，天冬氨酸在脫羧酶的作用下可轉(zhuǎn)化為丙氨酸。丙氨酸含量降低表明天冬氨酸的分解受到抑制。但是由于精氨酸和瓜氨酸及天冬氨酸和丙氨酸的變化趨勢(shì)并非完全相反，表明瓜氨酸和丙氨酸還有其他的代謝途徑。

由圖4 F可見(jiàn)，γ-氨基丁酸、半胱氨酸、鳥(niǎo)氨酸和色氨酸含量在發(fā)酵0～4 h時(shí)顯著下降，在4～8 h時(shí)顯著上升，在8～10 h時(shí)含量又顯著下降。其含量變化的原因有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

在發(fā)酵的過(guò)程中，游離氨基酸含量的變化是蛋白質(zhì)水解與乳酸菌分解氨基酸代謝的綜合結(jié)果。在40 ℃持續(xù)發(fā)酵10 h的過(guò)程中，總游離氨基酸含量先降后升，試驗(yàn)0～8 h以乳酸菌分解游離氨基酸占主導(dǎo)地位，8～10 h以蛋白質(zhì)水解占主導(dǎo)地位。谷氨酸、組氨酸、蛋氨酸、兩種芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）和支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且在0～4 h時(shí)其含量均極顯著下降；?；撬?、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和賴氨酸含量在4～8 h時(shí)極顯著下降；精氨酸和天冬氨酸含量在整個(gè)發(fā)酵期間呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。另外通過(guò)主成分分析，酸奶經(jīng)40 ℃發(fā)酵后10 h，其氨基酸水平進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的階段。

參考文獻(xiàn)：

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由圖4 F可見(jiàn)，γ-氨基丁酸、半胱氨酸、鳥(niǎo)氨酸和色氨酸含量在發(fā)酵0～4 h時(shí)顯著下降，在4～8 h時(shí)顯著上升，在8～10 h時(shí)含量又顯著下降。其含量變化的原因有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

在發(fā)酵的過(guò)程中，游離氨基酸含量的變化是蛋白質(zhì)水解與乳酸菌分解氨基酸代謝的綜合結(jié)果。在40 ℃持續(xù)發(fā)酵10 h的過(guò)程中，總游離氨基酸含量先降后升，試驗(yàn)0～8 h以乳酸菌分解游離氨基酸占主導(dǎo)地位，8～10 h以蛋白質(zhì)水解占主導(dǎo)地位。谷氨酸、組氨酸、蛋氨酸、兩種芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）和支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且在0～4 h時(shí)其含量均極顯著下降；?；撬?、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和賴氨酸含量在4～8 h時(shí)極顯著下降；精氨酸和天冬氨酸含量在整個(gè)發(fā)酵期間呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。另外通過(guò)主成分分析，酸奶經(jīng)40 ℃發(fā)酵后10 h，其氨基酸水平進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的階段。

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3 結(jié)論

在發(fā)酵的過(guò)程中，游離氨基酸含量的變化是蛋白質(zhì)水解與乳酸菌分解氨基酸代謝的綜合結(jié)果。在40 ℃持續(xù)發(fā)酵10 h的過(guò)程中，總游離氨基酸含量先降后升，試驗(yàn)0～8 h以乳酸菌分解游離氨基酸占主導(dǎo)地位，8～10 h以蛋白質(zhì)水解占主導(dǎo)地位。谷氨酸、組氨酸、蛋氨酸、兩種芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）和支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且在0～4 h時(shí)其含量均極顯著下降；牛磺酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和賴氨酸含量在4～8 h時(shí)極顯著下降；精氨酸和天冬氨酸含量在整個(gè)發(fā)酵期間呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。另外通過(guò)主成分分析，酸奶經(jīng)40 ℃發(fā)酵后10 h，其氨基酸水平進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的階段。

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