高效液相色譜法與酶聯免疫法檢測小麥中嘔吐毒素含量的比較研究

高艷 陶維春 王睿 沈躍麗

摘? ?要：高效液相色譜法、酶聯免疫法是常見的嘔吐毒素檢測方法，以小麥為樣品，依次利用高效液相色譜法、酶聯免疫法等對小麥嘔吐毒素進行了分析。對兩者嘔吐毒素檢測結果進行了對比分析，最終結果表明：高效液相色譜法、酶聯免疫法在小麥嘔吐毒素檢測環節，在250～1 450 μg/kg之間存在相關性，且高效液相色譜法測定的小麥嘔吐毒素含量小于酶聯免疫法測定的結果。

關鍵詞：高效液相色譜法;酶聯免疫法;小麥;嘔吐毒素;含量

嘔吐毒素又稱為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，其為鐮刀菌產生的單端孢霉毒素。依據糧食衛生標準的相關規定，小麥嘔吐毒素限量標準為1 000.0 μg/kg。嘔吐毒素對于糧食谷物的污染狀況與產毒菌株、溫度、濕度、通風、日照等因素有關。而現階段我國部分地區小麥嘔吐毒素含量出現嚴重超標現象，特別是在多雨的年份，因此強化嘔吐毒素檢測管理非常重要。現階段在小麥嘔吐毒素檢測過程中，高效液相色譜及酶聯免疫為常用的方法，通過對兩者檢測結果的相關性分析，可有效判斷小麥嘔吐毒素的有效檢測[1～3]。

1? ?高效液相色譜法材料及方法

1.1? ?試劑、材料

甲醇（色譜純）、聚乙二醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱、玻璃纖維濾紙（直徑11 cm、孔徑1.5 μm）。

1.2? ?主要儀器

色譜儀（配有紫外檢測器）、天平（感量0.001 g）、高速萬能粉碎機、空氣壓力泵、試驗篩（1 mm孔徑）、均質器（轉速大于10 000 rpm/min）、注射器（10 mL）。

1.3? ?方法

1.3.1? ?標準溶液的配制

將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標準溶液100 μg/mL用甲醇水（20∶80）分別稀釋成0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL標準工作液。

1.3.2? ?樣品前處理

（1）將樣品研磨，硬質的糧食用高速萬能粉碎機磨細并通過試驗篩（1.2 mm孔徑），不要磨成粉末，稱取25 g（精確到0.01 g）磨碎的試樣于100 mL容量瓶中加入5 g聚乙二醇，用水定容至刻度，混勻，轉移至均質杯中，高速攪拌2 min。定量濾紙過濾后以玻璃纖維過濾至濾液澄清，收集濾液于干凈的容器中。

（2）凈化。將2 mL濾液以1滴/2 s的速度緩慢通過免疫親和柱;用20 mL水沖洗柱子，流速1滴/s，棄去流出液，加入1.0 mL甲醇（色譜級）洗脫，流速自然重力，直至2～3 mL空氣通過柱體，收集全部洗脫液。

（3）高效液相色譜參考條件。色譜柱：C18柱，5 μm，150 mm×4.6 mm;流動相：甲醇+水（20+80）;流速：0.8 mL/min;柱溫：35 ℃;進樣量：50 μL;檢測波長：218 nm。

根據整體樣品峰保留時間進行定性分析，隨后依據相應峰面積利用外標法進行定量評估。

2? ?酶聯免疫法材料及方法

酶聯免疫法在實際應用中主要是利用酶聯免疫盒進行間接酶聯免疫檢測。

2.1? ?材料、試劑

嘔吐毒素檢測試劑盒、去離子水。

2.2? ?主要儀器

酶標儀：450 nm;恒溫培養箱：37 ℃;天平：感量0.001 g;粉碎機;離心機;微量移液器。

2.3? ?方法

2.3.1? ?樣品前處理

將5 g粉碎好的樣品加入25 mL去離子水，離心機5 000 rpm離心5 min，取上清液500 μL備用。

2.3.2? ?試劑盒檢測

本試驗使用蘇微牌DON檢測試劑盒。

取出試劑盒中所有試劑和微孔板回溫（20～25 ℃）30 min以上;將標準品孔、樣品孔進行編號，以便記錄位置;每孔加入250 μL洗滌液，放置40 s，甩掉拍干，重復一次;將標準溶液、樣品液各50 μL加入標記孔中，分別加入酶標物50 μL/孔、抗試劑50 μL/孔，培養箱37 ℃反應30 min;甩掉反應液，用洗滌液250 μL/孔充分洗滌5次，每次間隔30 s，拍干;依次分別加入底物液50 μL/孔、顯色液50 μL/孔，培養箱37 ℃反應15 min;之后加入終止液50 μL/孔，酶標儀450 nm，讀取每孔的吸光度OD值。

3? ?結果及討論

3.1? ?結果

經過小麥樣品加標回收試驗后，重復反應3次，并在樣品提取后分別使用高效液相色譜法、酶聯免疫法進行小麥提取物嘔吐毒素的檢測。其中高效液相色譜法在樣品處理前期需經過免疫親和柱，而酶聯免疫法可直接反應。在本次反應過程中，將高效液相色譜法過柱后的樣品又進行了酶聯免疫試驗，最終所得結果見表1。

3.2? ?分析

通過表1數據可得出，使用高效液相色譜法、酶聯免疫法分別對小麥提取物進行檢測，所測得的小麥嘔吐毒素含量高效液相色譜法小于酶聯免疫法，且當嘔吐毒素含量大于100 μg/g時，兩者之間的測量平均差值在425 ng/g以上，而在嘔吐毒素含量在100 ng/g以下時，兩者測量數值差值在105 ng/g以下。使用高效液相色譜法對于嘔吐毒素的檢測限度為100 ng/g。通過對整體測量數值的綜合評估，可得出兩者偏差影響因素。首先在高效液相色譜法的甲醇洗脫過程主要采用固相萃取的措施，而在實際洗脫過程中由于洗脫時間及洗脫頻率沒有得到有效控制，從而導致整體檢出率偏低;其次在酶聯免疫檢測過程中樣品稀釋倍數與高效液相色譜法稀釋倍數存在差異性，從而導致整體酶聯免疫檢測結果出現假陽性反應;再加上經過免疫親和柱后樣品可由免疫親和柱吸收一部分，從而導致免疫親和柱過濾后的樣品酶聯免疫法所得結果與高效液相色譜法最終差異不大。而且隨著樣品添加量的增加，其兩者的重復性呈現良好的態勢，這種情況表明酶聯免疫法試劑盒檢測結果具有一定穩定性。

通過直接過濾酶聯免疫法檢測結果分析，可得出在添加物濃度在100 ng/g時整體回收率為164.3%，而隨著添加物濃度的增加，酶聯免疫法檢測結果回收率出現下降趨勢。這種情況主要是由于添加物濃度過低會導致內在樣品雜質干擾程度增加，從而出現假陽性反應。而直接過濾酶聯免疫檢測法與經過免疫親和柱之后的酶聯免疫反應回收率存在差異，則主要是由于樣品提取液流經免疫親和柱的濃度損失。這就導致在實際檢測過程中，利用免疫親和柱高效液相色譜法進行小麥嘔吐毒素測定時，具有親和柱洗脫樣品不完全的風險，再加上高效液相色譜法在實際應用中需要對小麥樣品液進行過柱、淋洗、定容等措施，整體檢測時效不高，且耗費成本較大，因此其在實際應用中常用于在酶聯免疫法出現假陽性反應之后的確認工作。

4? ?總結

總而言之，酶聯免疫法在實際檢測過程中主要以抗原抗體特異性反應為依據，具有良好的檢測靈敏度及特異性。而且相較于高效液相色譜法而言，酶聯免疫法并不需要進行樣品前處理及免疫親和柱過柱等過程，從而有效地提高了樣品檢測效率。而高效液相色譜法主要是利用樣品純化，依據免疫親和柱過程中抗原與特異性抗體的結果理論，可以有效避免樣品檢測假陽性反應，具有檢測結果準確度較高的優良特點。在實際應用中可根據具體檢測需要，選擇適宜的檢測方法。

參考文獻：

[ 1 ] 張羽，唐亞芳，王燁旻.免疫親和柱凈化高效液相色譜法與酶聯免疫吸附法測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[J].糧食與油脂，2016，29（06）：78-81.

[ 2 ] 莊蕓蕾.膠體金免疫快速檢測卡與酶聯免疫法檢測小麥中嘔吐毒素的技術比較[J].糧食儲藏，2017，46（03）：38-41.

[ 3 ] 陸源，王韋崗，馬曉鳳，等.小麥粉中嘔吐毒素測定方法優化研究[J].廣州化工，2017，45（06）：115-116.