黃芪—當歸配伍對大鼠血管內膜增生模型細胞外基質的影響

彭熙煒　閻卉芳　黃娟　朱嘉歡　徐昊　黃小平　鄧常清

〔摘要〕 目的 研究黃芪和當歸配伍對大鼠血管內膜增生血管壁細胞外基質的影響。方法 將SD大鼠隨機分為黃芪與當歸（簡稱芪歸）1∶1、芪歸5∶1（3.9 g/kg）配伍組及單用黃芪組（2.17 g/kg）、單用當歸組（1.08 g/kg）、陽性藥物阿托伐他汀對照組（0.1 g/kg）和假手術組，采用球囊導管損傷大鼠血管內皮造成胸腹主動脈血管內膜增生模型，同時灌胃黃芪、當歸不同比例配伍藥物，連續給藥14 d后，取胸腹主動脈，用western blot法檢測增生內膜中基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、組織基質金屬蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）蛋白表達，免疫組化法檢測增生內膜中Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、纖維聯接蛋白（FN）表達。結果 與模型組比較，單用當歸組、芪歸1∶1組、阿托伐他汀組Col-Ⅰ、FN、MMP-9表達顯著降低（P<0.01，P<0.05）。芪歸5∶1組Col-Ⅰ、MMP-9表達強度顯著低于模型組（P<0.05）；單用黃芪組MMP-9表達強度顯著低于模型組（P<0.05）。單用黃芪組Col-Ⅰ、FN的表達強度與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05），芪歸5∶1組FN的表達強度與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。各組間TIMP的表達強度差異無統計學意義（P>0.05）。結論 黃芪-當歸配伍可抑制血管內膜增生時血管壁細胞外基質沉積，其中當歸為其主要的效應藥物，黃芪-當歸1∶1配伍的作用強于兩藥單用及其5∶1配伍。

〔關鍵詞〕 黃芪；當歸；配伍；血管內膜增生；細胞外基質

〔中圖分類號〕R285.5；R393；R54 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.005

〔Abstract〕 Objective To study the effect of compatibility of Astragali Radix （Huangqi） and Angelicae Sinensis Radix （Danggui） on the extracellular matrix of rats with intima hyperplasia. Methods Sprague-Dawley rats were randomly divided into different groups： Huangqi-Danggui 1∶1 group， Huangqi-Danggui 5∶1 group （3.9 g/kg）， Huangqi group （2.17 g/kg）， Danggui group （1.08 g/kg）， atorvastatin control group （0.1g/kg） and sham-operation group. A model of intimal hyperplasia of thoracoabdominal aorta was established by balloon catheter injury in rats. Then thoracoabdominal aorta was taken out after administration of Huangqi and Danggui for 14 days. The expression of matrix metallopeptidase-9 （MMP-9） and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 （TIMP-1） in proliferating endometrium was detected by Western blot. Immunohistochemistry was used to detect the expression of collagen-Ⅰ（Col-Ⅰ） and fibronectin （FN） in proliferative endometrium. Results Compared with the model group， the expression intensity of Col-Ⅰ， FN and MMP-9 in Danggui group， Danggui-Huangqi 1∶1 group， atorvastatin group were significantly lower （P<0.01， P<0.05）. The expression of Col-I and MMP-9 in Danggui-Huangqi 5∶1 group was significantly lower than that in model group （P<0.05）. The expression of MMP-9 in Danggui group was significantly lower than that in model group （P<0.05）. There was no significant difference in the expression intensity of Col-Ⅰand FN between the Danggui group and the model group （P>0.05）. There was no significant difference in the expression intensity of FN between the Huangqi-Danggui 5∶1 group and the model group（P>0.05）. There was no significant difference in the expression intensity of TIMP between each group（P>0.05）. Conclusion Huangqi and Danggui could inhibit the deposition of extracellular matrix during intimal hyperplasia. And Danggui is one of the main effect drugs. The effect of Huangqi-Danggui 1∶1 compatibility was stronger than the two drugs alone and compatibility of Huangqi-Danggui 5∶1.

〔Keywords〕 Astragali Radix； Angelicae Sinensis Radix； compatibility； vascular intimal hyperplasia； extracellular matrix

血管內膜增生是動脈粥樣硬化、高血壓血管重構和介入術后血管再狹窄等心血管疾病的病理生理基礎。在其復雜的發病機制中，血管內皮損傷后導致血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）從血管中膜遷移到內膜并增殖是其病理生理基礎。同時，VSMC在內膜遷移增殖過程中合成大量細胞外基質（extracellular matrix， ECM），沉積于血管壁，從而形成新生內膜，引起血管狹窄[1]。因此，抑制血管內皮損傷后VSMC增殖的同時，抑制ECM沉積和促進其降解，是防治血管內膜增生性病變的重要手段。

黃芪和當歸是臨床常用的中藥藥對，二者配伍既具有補氣生血作用，又可益氣活血。黃芪和當歸的配伍（簡稱芪歸）應用最有名的是公元1247年由李東垣所創的當歸補血湯（Danggui Buxue Tang， DBT），由黃芪一兩、當歸二錢組成，芪歸比為5∶1。研究表明，由黃芪和當歸配伍組方除具有促進造血[2]、增強免疫力[3]等作用外，還具有心血管保護作用[4]、抗動脈粥樣硬化[5]等藥理效應。本課題組前期研究發現黃芪-當歸在一定比例范圍內配伍有較好的抗血管內膜增生的作用，而且當歸為其抗血管內膜增生的主要藥效物質。黃芪配伍當歸可增強其抗血管內膜平生的作用，其中以芪歸1∶1配伍的作用為強[6]，但其作用機制尚未闡明。因此，我們基于血管內膜增生的病理生理機制，以抑制ECM沉積為切入點，進一步探討了黃芪和當歸配伍抗血管內膜增生的作用機制。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

2.0 mm×15 mm Runjin醫用球囊導管、Runthrough導絲（日本泰爾茂株式會社產品）。醫用球囊擴張壓力泵（江西省中醫院提供）。

1.2 實驗動物

SD雄性大鼠，體質量220～250 g，SPF級，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，大鼠動物許可證號：SCXK（湘）2013-0004。實驗前適應性飼養1周，飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，濕度45%～65%、室溫25 ℃，喂食標準飼料，自由攝水。實驗場地許可證號：SCXK（湘）2013-0005。

1.3 藥物及制備

黃芪（產地內蒙古）、當歸（產地甘肅）由湖南中醫藥大學附一醫院藥劑科統一購進并經湖南中醫藥大學附一醫院左亞杰教授鑒定，黃芪為膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.） Bunge的干燥根，當歸是傘形科植物當歸Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根。根據本課題組以前的研究結果，黃芪和當歸在1∶1配伍時具有較好的抑制血管內膜增生的作用[6]，而黃芪和當歸的傳統配伍是5∶1，故設立黃芪-當歸1∶1、5∶1配伍及單用藥物組。按不同配伍，分別稱取藥材，以水熱回流法提取3次（第一次8倍量水，提取1 h；第二、三次6倍量水，提取1 h），合并3次提取液，過濾后在60 ℃真空條件下蒸發濃縮制成浸膏，取出浸膏用蒸餾水定容為一定濃度：黃芪0.22 g/mL（生藥）、當歸0.11 g/mL（生藥）、芪-歸不同配伍組0.39 g/mL（生藥）。藥液中加入苯甲酸鈉0.1%，分裝后置-4 ℃冰箱中保存備用。阿托伐他汀鈣，浙江新東港藥業股份有限公司生產，批號：20160803，規格：10 mg/片。臨用時用蒸餾水溶解制成混懸液。

1.4 主要試劑

兔抗大鼠基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）多克隆抗體、兔抗大鼠組織基質金屬蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）多克隆抗體、兔抗大鼠Ⅰ型膠原（Col-I）多克隆抗體、兔抗大鼠纖維聯接蛋白（FN）多克隆抗體、β-actin多克隆抗體為英國abcam公司產品。DAB顯色試劑盒（批號：SP-900D）、免疫組化染色試劑盒（批號：SP-9001）為北京中杉金橋生物有限公司產品。牛血清蛋白（BSA）為華美生物工程有限公司產品。PVDF膜為瑞典Amersham公司產品。ECL化學發光試劑盒為美國GE Healthcare公司產品。其它試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 實驗分組及模型制備方法

將大鼠隨機分為7組：假手術組、模型組、單用當歸組、單用黃芪組、芪歸1∶1組、芪歸5∶1組、阿托伐他汀組。每組實驗成功的大鼠數為8～10只。采用球囊損傷后血管再狹窄模型[7]。假手術組∶只分離暴露左頸總動脈后縫合，不進行球囊損傷術。術后灌服等量蒸餾水。模型組∶行胸腹主動脈球囊損傷造模，不進行藥物干預。術后灌服等量蒸餾水。阿托伐他汀組∶胸腹主動脈球囊損傷術后灌服阿托伐他汀藥液。芪歸不同配比組∶胸腹主動脈球囊損傷術后灌服芪歸不用配比藥液。術后第一天開始給藥，連續14 d后檢測。給藥劑量為∶單用當歸組1.1 g/kg，單用黃芪組2.2 g/kg，芪歸配伍組3.9 g/kg（芪歸1∶1配伍為1.95 g/kg+1.95 g/kg，芪歸5∶1配伍為3.25 g/kg+0.65 g/kg），阿托伐他汀組10 mg/kg。給藥體積為10 mL/kg。

2.2 觀察指標

2.2.1 標本的采集 末次給藥后次日麻醉動物，截取胸腹主動脈血管。用于western blot檢測的血管直接放入凍存管，然后置于-80 ℃冰箱保存。用于免疫組化檢測的血管以4%多聚甲醛固定，置于4 ℃冰箱保存。

2.2.2 免疫組織化學法測定增生內膜中FN、Col-I表達 以免疫組織化學法測定增生內膜中FN、Col-I的表達（一抗稀釋倍數∶FN 1∶100，Col-I 1∶100），操作按說明書。光鏡下可見陽性表達呈棕黃色點狀或纖維狀染色，集中在細胞膜、細胞漿或細胞間。陰性則無棕黃色染色。用MIAS醫學圖像分析系統拍照，再每張切片分別選取3個不同視野，用image-pro plus 6.0圖像分析軟件測量單位面積的陽性染色積分光密度（integrated optical density，IOD），取平均值進行統計分析。

2.2.3 western blot法測定MMP-9、TIMP-1蛋白表達 取出血管組織，剔除外膜結締組織，盡量剪碎，加入1 mL的RIPA裂解液，2 μL PMSF，研磨至無明顯的組織碎片，再置于冰上0.5 h后，將組織勻漿液移至1.5 mL的離心管中，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，取上清液。以BCA法測定樣品的蛋白含量。按配方制備10%聚丙烯酰胺分離膠和5%聚丙烯酰胺濃縮膠，將凝膠轉移至電泳槽。取樣品蛋白，加入2×SDS loading buffer、β-巰基乙醇、裂解液調整蛋白濃度（1 μg/μL），置沸水中煮10 min使蛋白變性。將待分析樣品和Marker依次加入，每個泳道加入20 μL。然后進行電泳。電泳完畢后，將凝膠放在電轉液中，恒流20 mA轉膜，4 ℃冰箱中過夜，使凝膠目的蛋白轉移至PVDF膜上。將PVDF膜用PBS液洗2次，然后放入5%PBS-脫脂奶粉封閉液內封閉90 min。將PVDF膜放入雜交袋中，加入約1 mL一抗（MMP-9 1∶1 000， TIMP-l l∶1 000， β-actin 1∶1 000），在室溫下搖床（70 r/min）孵育90 min。PBS洗3次，每次10 min。再將上述與一抗孵育的PVDF膜加入稀釋的二抗（羊抗兔IgG 1∶1 000），在室溫下搖床（70 r/min）孵育90 min。PBS洗3次，每次10 min。以ECL顯色液顯色，最后用凝膠成像系統觀察、拍照。用Quantity One圖像分析軟件測定目的條帶的累積光密度（integrated optical density，IOD），以目的條帶的IOD與β-actin條帶的IOD的比值作為該目的蛋白的相對表達量。

2.3 統計分析方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，實驗數據采用“x±s”表示。多組間均數的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett's T3檢驗。P<0.05表示有統計學意義。3 結果

3.1 各組增生內膜中Col-Ⅰ、FN表達的比較

與假手術組比較，模型組增生內膜Col-Ⅰ表達顯著增強（P<0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀組增生內膜Col-Ⅰ表達強度顯著降低（P<0.01）；單用當歸組、芪歸1∶1組和芪歸5∶1組增生內膜Col-Ⅰ表達強度也顯著低于模型組（P<0.05）；單用黃芪組與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。各藥物組之間增生內膜Col-Ⅰ表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、圖1。

與假手術組比較，模型組增生內膜FN表達顯著增強（P<0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀組、單用當歸組增生內膜FN表達強度顯著降低（P<0.01）；芪歸1∶1組也較模型組FN表達強度降低（P<0.05）；單用黃芪組、芪歸5∶1組與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。各藥物組之間增生內膜FN表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、圖2。

3.2 各組MMP-9、TIMP-1蛋白表達的比較

與假手術組比較，模型組MMP-9蛋白表達顯著增強（P<0.01）。與模型組比較，單用黃芪組MMP-9蛋白表達強度低于模型組（P<0.05）；阿托伐他汀組、單用當歸組、單用黃芪組、芪歸1∶1組和芪歸5∶1組MMP-9蛋白表達強度顯著低于模型組（P<0.01）。各藥物組之間MMP-9蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。

與假手術組比較，模型組TIMP-1蛋白表達強度無顯著差異（P>0.05）。與模型組比較，阿托伐他汀組、單用當歸組、單用黃芪組、芪歸1∶1組和芪歸5∶1組TIMP-1蛋白表達強度無明顯差異（P>0.05）。各藥物組之間TIMP-1蛋白表達強度無顯著差異（P>0.05）。見表2、圖3。

4 討論

ECM是分布在細胞表面或細胞之間的大分子， 主要由多糖、蛋白質或蛋白聚糖等組成。ECM在維持血管壁的完整性和血管壁細胞的正常功能中扮演著重要的角色。在動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄等病變中ECM與VSMC的相互作用是其重要的病理因素。血管內膜增生性疾病中，血管中膜的VSMC增殖并遷移至內膜后合成大量ECM并在血管壁沉積，從而進一步促進內膜的增生。層黏連蛋白、彈性蛋白、膠原和纖維連接蛋白等是ECM的主要組成成分，其中膠原占據大部分，以Ⅰ型和Ⅲ膠原為主[8]。Nikkari等[9]研究表明，血管內皮損傷第3天起增加最明顯的是Ⅰ型膠原，2周達高峰后便逐漸下降。在增生的血管內膜中，可見ECM大量沉積，主要成分是纖維聯接蛋白和膠原，占據了89%，僅有11%為細胞成分，ECM的沉積促進了VSMC的增殖與向內膜的遷移[10]。

另外在ECM的合成與降解過程中基質金屬蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMPs）起著另一關鍵的作用。目前發現的MMPs有20種之多，其中對膠原的合成與降解起著關鍵作用的為MMP-2與MMP-9等。在正常情況下組織基質金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitormatrix metallo proteinase，TIMPs）對MMPs的代謝起抑制作用，目前已發現四種TIMPs對MMPs有著顯著的抑制作用，即為：TIMP-l、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMPs抑制MMPs的機制是其與MMPs以1∶1的比例非共價結合。在介入術后血管內皮損傷，TIMPs的合成與表達可以抑制血管內膜增生，其機制是可抑制VSMC的增殖與遷移，并能誘導VSMC凋亡[11]。Southgate等[12]研究發現：在行豬冠狀動脈剝脫術后，MMP-2、MMP-9在術后第3天的表達明顯增強，并且其表達強度能維持21 d不衰減。有研究發現[13]MMPs抑制劑能有效抑制新生的血管內膜形成，在球囊血管損傷造模后即開始給予MMPs抑制劑，可見術后1周內ECM成分中膠原的合成明顯減少33%。因此，在血管增殖性病變的防治中，抑制ECM的過度沉積，對于其防治具有重要的治療學意義。Wu等[14]研究發現，在血管損傷模型大鼠，三七總皂苷能顯著降低增生內膜中纖維聯接蛋白（FN）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達，從而抑制ECM在內膜中的沉積并降解ECM相關蛋白，達到抑制血管內膜增生的作用。有研究發現[7]：補陽還五湯能抑制纖維聯接蛋白（FN）、膠原Ⅰ（Col-Ⅰ）的表達，降解ECM相關蛋白表達，抑制ECM在血管壁的沉積。張偉等[15]研究發現：補陽還五湯中生物堿和苷能顯著抑制ECM的沉積，其作用機制是通過抑制Col-Ⅰ及 FN的表達而實現。因此，抑制ECM在血管內膜中的沉積是防治血管增殖性病變的重要靶點。中醫藥具有多環節多靶點的調節作用，可能通過調節ECM代謝而發揮其抗血管內膜增生的作用。

本研究表明，球囊導管損傷血管內膜后，可造成明顯的血管內膜增生。增生內膜中細胞外基質成分Col-Ⅰ、FN表達增強，說明在增生血管內膜中ECM合成增加，進一步促進了VSMC增殖和內膜的增生。阿托伐他汀、單用當歸、芪歸1∶1配伍可抑制增生內膜中Col-Ⅰ、FN的表達。提示當歸及黃芪-當歸配伍可抑制ECM在增生內膜中的沉積，從而減輕血管內膜增生的程度。研究還發現，單用黃芪對Col-Ⅰ、FN表達無明顯抑制作用，芪歸5∶1組能抑制Col-Ⅰ的表達，但對FN表達無明顯抑制作用。表明單用黃芪對血管內膜中ECM沉積無顯著影響，芪歸5∶1配伍抑制ECM沉積的作用弱于1∶1配伍。

一般認為，MMP-9表達增強可促進ECM的降解，TIMP表達增強可抑制ECM的降解。本研究發現在球囊損傷模型，血管MMP-9表達增強，而TIMP-1則無明顯變化。這與血管損傷時，通過誘導MMP-9基因表達及促進炎性細胞分泌MMP-9有關，使得MMP與TIMP之間的平衡被破壞[16]。MMP-9的大量表達雖然可以促進ECM的降解，但其同時催化降解VSMC周圍的基底膜，使之與周圍的基質接觸，促使VSMC表型轉變為具有遷移和增生能力的分泌型VSMC，并且ECM的降解使得中膜VSMC得以擺脫ECM的束縛，加速了VSMC的遷移，從而促進血管內膜增生[17]。另外MMP-9的大量表達可促進脂蛋白向內膜下沉積及炎性細胞的浸潤，可導致斑塊形成，加速內膜增生[18]。所以抑制MMP-9的表達可起到穩定斑塊、抑制VSMC增殖與遷移的作用。本研究發現阿托伐他汀、黃芪、當歸、芪歸1∶1及芪歸5∶1配伍對MMP-9的表達有明顯的抑制作用，表明其能通過抑制MMP-9的表達而達到糾正ECM清除機制失衡、抑制VSMC增殖與遷移及穩定斑塊的作用。研究還發現，單用黃芪對MMP-9的表達抑制作用較弱，說明黃芪并非抑制MMP-9表達的主要藥物，但黃芪和當歸配伍可增強其抑制MMP-9表達的作用。

總之，單用當歸、芪歸1∶1配伍可抑制增生內膜中ECM沉積，從而抑制VSMC遷移增殖。在黃芪-當歸配伍中，當歸為其主要的效應藥物，黃芪-當歸1∶1配伍的作用強于5∶1。

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（本文編輯 楊 瑛）