苓桂劑調(diào)節(jié)固有免疫治療青春期尋常型痤瘡

袁玉亮 朱瑞麗 孫士鵬 魏華民

摘要目的：觀察苓桂劑治療青春期尋常型痤瘡的臨床療效，并從免疫調(diào)節(jié)方面探討其可能的機(jī)制。方法：選取2016年3月至2017年11月中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)收治的青年期尋常型痤瘡患者62例作為觀察組以及同時(shí)期健康志愿者20例作為對(duì)照組，苓桂劑治療10 d后評(píng)估臨床有效率并用流式細(xì)胞儀分析治療前后患者外周血的CD14+TLR2+及ELISA法檢測(cè)IL4、IL8、TNFα和COX2水平。結(jié)果：所有患者均不同程度緩解，CD14+TLR+在正常組、治療前、治療后分別為為（78±5）%、（923±67）%、（812±46）%，治療后較治療前下降明顯（P=0044），IL4、IL8、TNFα和COX2水平治療后亦顯著下降（P<005）。結(jié)論：苓桂劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)固有免疫途徑改善青春期尋常型痤瘡。

關(guān)鍵詞青年期尋常型痤瘡；苓桂劑；Toll樣受體；固有免疫調(diào)節(jié)

Effects of Linggui Prescription on Adolescent Acne Vulgaris Through Innate Immunity Regulation

Yuan Yuliang1， Zhu Ruili1， Sun Shipeng1， Wei Huamin2

（1 Guang′anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 102618， China； 2 Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China）

AbstractObjective：To observe the clinical effects of Linggui prescription on adolescent acne vulgaris， and investigate the possible mechanism of it on immune regulation. Methods：Sixtytwo cases of adolescent acne vulgaris and 20 healthy cases were involved in the study. After 10 days of Chinese herbal treatment， clinical efficient was evaluated， and also rate of CD14+TLR2+ and level of IL4， IL8， TNFα and COX2 were detected in peripheral blood by Flow Cytometer and ELISA. Results：All cases had a clinical remission in different degree， rate of CD14+TLR+ in healthy control， pretreatment and aftertreatment group were （78±5）%， （923±67）%， （812±46）%. The rate had a significant decrease in aftertreatment v.s. pretreatment （P=0044）， level of IL4， IL8， TNFα and COX2 were also markedly decreased after treatment （P<005）. Conclusion：Linggui prescription might improve adolescent acne vulgaris through innate immunity regulation.

Key WordsAdolescent acne vulgaris； Linggui Prescription； Tolllike receptor； Innate immunity regulation

中圖分類號(hào)：R2759文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.012

尋常型痤瘡是青少年多發(fā)的一種皮膚病，也是中醫(yī)治療的優(yōu)勢(shì)病種之一。既往中醫(yī)前輩根據(jù)時(shí)代特點(diǎn)，多用調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、祛風(fēng)利濕止癢、排膿解毒消癰的藥物[13]，但根據(jù)中醫(yī)辨證思想，不同時(shí)代的人體質(zhì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，導(dǎo)致相應(yīng)的治療方法不斷發(fā)生演變。根據(jù)筆者觀察，現(xiàn)代的青年人，具有類似的生活習(xí)慣，如運(yùn)動(dòng)少，喜冷食、辣食，多吹冷空調(diào)，飲料喝的較多等，這些共同的不良習(xí)慣導(dǎo)致了該群體的青年人存在一個(gè)共同的體質(zhì)傾向即：營(yíng)衛(wèi)失調(diào)、痰濕內(nèi)盛，具體表現(xiàn)為容易感冒或反復(fù)發(fā)生鼻炎、咽炎，舌體胖大多有齒痕，手足易冷，面色多青暗，痤瘡多表現(xiàn)為色暗、灰滯等，這些不僅反映了榮衛(wèi)郁滯、寒邪傷陽(yáng)的病機(jī)，也對(duì)治療提出了新的要求，應(yīng)用既往的涼血解毒藥為主的治療方法可能不能滿足此類人群的需要[46]。針對(duì)新的辨證變化，結(jié)合既往中醫(yī)研究的成果，我們提出應(yīng)用苓桂劑為主的方藥治療此類痤瘡，臨床效果滿意，為明確其可能的機(jī)制，本研究結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的檢驗(yàn)方法，對(duì)苓桂劑治療青春期尋常型痤瘡進(jìn)行了新的機(jī)制探索。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

11一般資料選取2016年3月至2017年11月中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)收治的青年期尋常型痤瘡患者62例作為觀察組以及同時(shí)期健康志愿者20例作為對(duì)照組，均簽署知情同意書，本研究采用前后對(duì)照的方法，分別于患者入組前后收集患者的臨床資料：包括患者一般資料（性別、年齡等）、皮損程度、不良反應(yīng)等；另外于患者前后清晨采集肘靜脈血5 mL，低溫（4 ℃）離心15 min（2 500 r/min），吸取上清液，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（審批號(hào)：2015EC05603）。

12診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》（趙辨，江蘇鳳凰科學(xué)技術(shù)出版社，2009年12月第1版）中診斷標(biāo)準(zhǔn)：以毛囊性丘疹、黑頭粉刺、膿皰、結(jié)節(jié)、囊腫和瘢痕為主要皮損表現(xiàn)，伴有皮脂溢出，好發(fā)于面部、上胸及背部，呈對(duì)稱分布、慢性經(jīng)過(guò)。參照Pillsbury及國(guó)際改良痤瘡分級(jí)法進(jìn)行臨床分級(jí)：I級(jí)：主要皮損為散發(fā)至多發(fā)黑頭粉刺，可伴發(fā)炎性丘疹，總病灶數(shù)10～30個(gè)；II級(jí)：主要皮損為粉刺，并有中等數(shù)量的丘疹和潛在性膿皰，局限在面部，總病灶數(shù)31～50個(gè)；III級(jí)：主要皮損為炎性丘疹和膿皰，可見深在性膿皰和大的炎性皮損，發(fā)生與顏面、頸部、胸背部，總病灶數(shù)50～100個(gè)，結(jié)節(jié)/囊腫<3個(gè)。IV級(jí)：大量的丘疹和膿皰，結(jié)節(jié)、囊腫，伴瘢痕形成，發(fā)生于上半身總病灶數(shù)>100個(gè)，結(jié)節(jié)/囊腫>3個(gè)。

13納入標(biāo)準(zhǔn)1）符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；2）年齡處于青春期即10～20歲。3）主要癥狀除痤瘡?fù)舛嘤腥菀赘忻盎蚍磸?fù)發(fā)生鼻炎、咽炎，舌體胖大多有齒痕，手足易冷，面色多青暗，痤瘡多表現(xiàn)為色暗、灰滯等。

14排除標(biāo)準(zhǔn)1）舌苔黃或黃膩者；2）面部油膩光亮，口臭，尿赤，便秘者；3）伴有明顯的心煩易怒、胸脅脹痛者；4）伴有口干、五心煩熱、失眠多夢(mèng)、舌紅少苔、脈細(xì)者。5）伴有嚴(yán)重的先天性疾病和慢性病者。6）對(duì)中藥有過(guò)敏史者。

15脫落與剔除標(biāo)準(zhǔn)1）患者失訪；2）患者主動(dòng)撤回知情同意書；3）患者未按規(guī)定用藥致使療效評(píng)估受影響者。

16治療方法對(duì)所有患者進(jìn)行告知，主要包括以下內(nèi)容：1）避免受風(fēng)寒，尤其是以汗后為主；2）避免辛辣、生冷、油膩食物及大量飲水；3）避免作息不規(guī)律，尤其是熬夜，長(zhǎng)期面對(duì)電腦、手機(jī)等電子產(chǎn)品。除滿足以上條件外，每名入組患者均需每日煎服苓桂劑：桂枝9 g、白芍9 g、生姜9 g、大棗12 g、炙甘草6 g、茯苓12 g、白術(shù)12 g。熱重加黃芩10 g，1劑/d，水煎服，10劑為1個(gè)療程。

17觀察指標(biāo)

171外周血CD14+細(xì)胞染色及檢測(cè)CD14FITC抗體、IgG1FITC抗體、IgG2aPE抗體、TLR2PE抗體購(gòu)自于美國(guó)BD公司（產(chǎn)品批號(hào)分別為557153，550616，562302，565349），分別于流式管底部加入相應(yīng)抗體2 μL，加入抗凝血100 μL，震蕩混勻，室溫避光孵育20 min；加入2 mL溶血素（美國(guó)BD公司）震蕩混勻，室溫避光5 min后1 300 r/min離心10 min；棄上清，加入2 mL PBS震蕩混勻后1 300 r/min離心10 min；重復(fù)以上過(guò)程；用BECKMAN COULTER流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)外周血中CD14+TLR2+細(xì)胞的陽(yáng)性率。

172外周血中炎性反應(yīng)因子的水平采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定患者治療前后血清白細(xì)胞介素4（IL4）、白細(xì)胞介素8（IL8）、腫瘤壞死因子α（TNFα）和環(huán)氧合酶2（COX2）的變化（試劑盒購(gòu)于美國(guó)Abcam公司），按照說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)述步驟如下：1）按說(shuō)明進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋；2）加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作相同）、待測(cè)樣品孔；3）溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min；4）配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。5）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。7）溫育：操作同3）；8）洗滌：操作同5）；9）顯色：每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。10）終止及測(cè)定：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測(cè)定：以空白孔凋零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)加在終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

18療效判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)患者皮損情況予以評(píng)分分級(jí)I級(jí)皮損評(píng)分為1～3分，II級(jí)皮損評(píng)分為4～6分，III級(jí)皮損評(píng)分為7～9分，IV級(jí)皮損評(píng)分為10～12分，由3位醫(yī)師共同評(píng)分，取平均值作為患者評(píng)分等級(jí)。按照評(píng)分情況進(jìn)行療效評(píng)估：療效指數(shù)=（治療前評(píng)分-治療后評(píng)分）/治療前評(píng)分×100%，無(wú)效：療效指數(shù)<20%；有效：療效指數(shù)21%～60%；顯效：療效指數(shù)61%～95%；治愈：療效指數(shù)>96%。

19統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 200統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，資料描述數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，治療前后數(shù)據(jù)采用組內(nèi)t檢驗(yàn)，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

212組臨床療效比較觀察組患者治療前后皮損分?jǐn)?shù)分別為（67±21）分和（16±04）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0023）。經(jīng)過(guò)治療后無(wú)效0例，有效14例，顯效25例，治愈23例。

22對(duì)照組及觀察組患者外周血CD14+單核細(xì)胞TLR2分析見圖1。

23對(duì)照組及觀察組外周血血清IL4、IL8、TNFα和COX2水平將2組人群外周血同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果如下，觀察組較對(duì)照組組IL8及COX2均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），經(jīng)治療后較治療前水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。

3討論

目前公認(rèn)的痤瘡病因是丙酸桿菌感染，由其激活的炎性反應(yīng)是痤瘡的起始和加重環(huán)節(jié)。目前的研究認(rèn)為在該病原體入侵機(jī)體后，與固有免疫細(xì)胞表面的識(shí)別受體相結(jié)合，激活效應(yīng)細(xì)胞，啟動(dòng)一系列免疫反應(yīng)是痤瘡發(fā)展的根本原因。Toll樣受體是一類重要的模式識(shí)別受體，在生物界中廣泛存在，是固有免疫系統(tǒng)的重要組成之一，在機(jī)體固有免疫中發(fā)揮重要的抗感染作用，主要通過(guò)TLR2和TLR4識(shí)別許多病原微生物及分枝桿菌產(chǎn)物，激活核因子而促進(jìn)多種炎性因子、黏附分子及抗微生物肽的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。和痤瘡相關(guān)的主要受體為TLR2[79]。TLR2是一種參與免疫應(yīng)答的跨膜非催化性蛋白質(zhì)分子，在機(jī)體皮膚、黏膜等物理屏障受損是激活免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要分子[10]，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路誘導(dǎo)IL8、IL4及TNFα聚集并使COX2表達(dá)增加，促進(jìn)炎性反應(yīng)[1113]。近期的研究證實(shí)，上述炎性反應(yīng)因子和痤瘡的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可作為痤瘡治療評(píng)估的客觀標(biāo)準(zhǔn)[14]。

通過(guò)中藥調(diào)節(jié)痤瘡患者的固有免疫減緩炎性反應(yīng)是本研究的主要內(nèi)容。通過(guò)補(bǔ)法治療痤瘡文獻(xiàn)少有報(bào)道，這也是本研究重要的創(chuàng)新點(diǎn)之一，我們前期通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)青春期痤瘡患者的體質(zhì)多數(shù)屬于濕盛陽(yáng)傷、營(yíng)衛(wèi)失調(diào)類型，基于該類患者的體質(zhì)類型，我們?cè)囉霉鹬?lián)合苓桂術(shù)甘湯，并在本實(shí)驗(yàn)中證實(shí)：以調(diào)補(bǔ)為主的該方法治療青春期尋常型痤瘡不僅可有效改善患者的皮損狀態(tài)，而且降低患者外

周血中單核細(xì)胞表面TLR2的表達(dá)，同時(shí)降低血清IL4、IL8、TNFα和COX2水平。

首先，和健康人群比較，痤瘡患者TLR2水平表達(dá)顯著上調(diào)，和林玲等人的研究結(jié)果一致[15]，提示固有免疫失調(diào)是此類患者的主要特點(diǎn)之一，從固有免疫調(diào)節(jié)方面來(lái)治療皮膚病包括痤瘡已成為重要的研究方向之一[1621]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)中藥治療后患者外周血單核細(xì)胞TLR2表達(dá)顯著降低，提示調(diào)節(jié)固有免疫可能是該方法治療痤瘡的主要機(jī)制之一。其次，作為TLR2下游信號(hào)通路中的關(guān)鍵促炎性反應(yīng)因子IL4、IL8、TNFα和COX2均在痤瘡患者中有較高表達(dá)，水平痤瘡丙酸桿菌引起的機(jī)體免疫失衡伴有明顯的炎性反應(yīng)參與，經(jīng)過(guò)中藥治療后，患者體內(nèi)的炎性反應(yīng)標(biāo)記物下降，說(shuō)明中藥改善了患者炎性反應(yīng)免疫之間的平衡，在提高免疫降低炎性反應(yīng)方面有重要作用。總之，苓桂劑的應(yīng)用可能通過(guò)下調(diào)CD14+單核細(xì)胞TLR2表達(dá)及分泌相關(guān)炎性因子改善體內(nèi)的炎性反應(yīng)，從而使固有免疫“正常化”而減輕痤瘡。

本研究的局限性：1）本研究只納入了部分特定的痤瘡人群，由于不同年齡及發(fā)作時(shí)間有別，患者體質(zhì)各異，此種方法可能只適用于部分痤瘡患者，應(yīng)該在中醫(yī)辨證下合理應(yīng)用。2）本實(shí)驗(yàn)未能揭示苓桂劑激活固有免疫的具體信號(hào)通路及靶點(diǎn)，下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)更能證實(shí)苓桂劑的主要靶點(diǎn)及內(nèi)在機(jī)制。

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（2018-02-26收稿責(zé)任編輯：張雄杰）