探討建立大鼠半乳糖性白內障模型的方法

鐘蕾　王婷　王濤　黎韋華　凌士奇

【摘要】目的探討建立大鼠半乳糖性白內障模型的方法。 方法48只大鼠，隨機分為8組，每組6只，雙眼均為觀察眼，采用腹腔注射法建立大鼠半乳糖性白內障。每日對每只大鼠進行稱量，A組：50%D半乳糖10 g/（kg·d）；B組：50%D半乳糖15 g/（kg·d）；C組：50% D半乳糖10 g/kg，每日2次；D組：50% D半乳糖15 g/kg，每日2次；E、F、G、H的注射劑量等同對應A、B、C、D組，A、B、C、D組在第10日開始加喝10% D半乳糖水。每3 d用裂隙燈觀察晶狀體的渾濁程度一次。結果觀察至第30日時，除最低劑量的E組（3333%）外，各實驗組的造模成功率均為100%，A～H各組的死亡率（%）分別為0、3333、6667、3333、0、1667、0、1667。總死亡率為2083%，造模成功率為7083%。結論腹腔注射半乳糖可以成功建立白內障動物模型，且造模的成功率較高，死亡率較低，是較穩定的半乳糖白內障動物模型。

【關鍵詞】半乳糖；白內障；大鼠

Investigation of the method of establishment of rat models with galactose cataractZhong Lei， Wang Ting， Wang Tao， Li Weihua， Ling Shiqi Department of Ophthalmology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University，Guangzhou 510630， China

Corresponding author，Ling Shiqi， Email：lingshiqi123@163com

【Abstract】ObjectiveTo explore the method of establishment of rat models with galactose cataract MethodsFortyeight rats were randomly divided into 8 groups（n= 6） Bilateral eyes were regarded as the observation eyes The rat models with galactose cataract were established by intraperitoneal injection Each rat was weighed daily In group A， 50% Dgalactose 10 g/kg was administered once daily In group B， 50% Dgalactose 15 g/kg was given once daily In group C， 50% Dgalactose 10 g/kg was administered twice daily In group D， 50% Dgalactose 15 g/kg was injected twice a day The injection doses in groups E， F， G and H corresponded to those in groups A， B， C and D， respectively In groups A， B， C and D， 10% Dgalactose water was supplemented on the 10th day The opacity of lenses was observed by the slitlamp biomicroscope every 3 d ResultsOn the 30th day， the success rate of each group was 100%， except for the group E （3333%） in which the lowest dose was administered The mortality rates in groups AH were 000%，3333%，6667%，3333%，000%，1667%，000%，1667%， respectively The total mortality rate was 2083%， and the success rate of model establishment was 7083% ConclusionIntraperitoneal injection of galactose can successfully establish the animal models of cataract with high success rate and low mortality rate The established rat model with galactose cataract is relatively stable

【Key words】Galactose； Cataract； Rat

糖尿病患者在2013年約達382億，2035年預計達到592億[1]。白內障是糖尿病的最常見并發癥之一，更值得重視的是，白內障已被確定為全球視力障礙和失明的主要原因。對于臨床研究與治療，積極尋找病因是治療及預防疾病最關鍵的步驟，因此建立穩定可靠的動物模型進行實驗研究，有助于日后降低視力損害及白內障盲的發病率[2]。半乳糖誘導的白內障大鼠模型已廣泛應用，是較好反映人類糖尿病性白內障和年齡相關性白內障的動物模型。半乳糖模型的建模方法一直存在爭議，國外學者認為腹腔注射不能夠形成糖性白內障[3]。但是在該領域，我國早期的一些學者發現腹腔注射半乳糖可誘發白內障的形成，還有學者采用球后注射、皮下注射等方法誘發白內障，造模的方式、方法與劑量都不相同，且引起的動物死亡率較高，基本達半數以上[4]。我們經過一系列的實驗摸索，探討半乳糖的用量及方法，旨在提供穩定可靠且死亡率較低的白內障動物模型制備方法，為日后白內障的實驗研究及治療提供一個參考方案。

材料與方法

一、實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠3～4周齡48只（中山大學中山眼科動物實驗中心提供），體質量80～100 g，復方托吡卡胺散瞳后，裂隙燈下晶狀體澄清透明且無其他眼部疾病。檢查實驗動物的使用遵循國家《實驗動物管理條例》及通過動物倫理委員會的批準。

二、藥品與器材

D半乳糖（Genview），滅菌水（中國大冢制藥有限公司），復方托吡卡胺滴眼液（日本參天制藥株式會社）； SLD7/DC3/IMAGEnet裂隙燈（日本Topcon公司）；恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司），體重秤（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

三、分組

經普通顆粒飼料適應性喂養1周后，48只大鼠隨機分為8組，每組6只。為了減少左右眼可能發生差異對實驗結果的影響，我們對實驗中的大鼠進行了雙眼的觀察研究。各組標為A、B、C、D、E、F、G、H。

四、大鼠半乳糖性白內障模型的制作

每天注射前對每只大鼠稱取體質量，體質量精確到小數點后1位，嚴格按照相應體質量的劑量進行注射。實驗劑量如表1所示，實驗周期共30 d。

表1實驗方法及劑量分組腹腔注射50% D半乳糖劑量A、E10 g/（kg·d）B、F15 g/（kg·d）C、G10 g/kg，每日2次D、H15 g/kg，每日2次注：A、B、C、D組第10日開始加喝10% D半乳糖水。

五、裂隙燈照相

不使用麻醉劑及任何鎮靜藥的狀態下，每3 d用復方托吡卡胺滴雙眼散瞳后，在SL130裂隙燈對大鼠進行晶狀體渾濁程度的觀察并記錄及拍照，直至實驗結束。使用裂隙燈觀察者共3名，均為有熟練眼科臨床經驗且不知曉本次實驗內容及進程者，裂隙燈觀察采用彌散光照射法[5]。

六、晶狀體渾濁程度的指標

根據國際公認的白內障分級，共分為8級[6]。具體如下：0級，晶狀體完全透明，未見任何混濁；1a級，晶狀體出現赤道部環樣水泡；1b級，空泡覆蓋前皮質層的范圍≥1/3； 1c級，空泡覆蓋前層皮質范圍≥2/3； 2a級，前層皮質有部分范圍透明且仍有空泡存在； 2b級，前層皮質仍有部分透明范圍，但不伴有空泡的存在；3級，均一的皮質性混濁；4級，晶狀體核出現混濁。

3名觀察者對大鼠白內障渾濁程度進行評級，統計后改成相對應分數，并采用的渾濁指數進行換算，并取平均值[7]。渾濁指數=（各級白內障的得分×相應分級的眼數）/組內總眼數。

七、 統計學處理

應用SPSS 230進行統計分析，用ShapiroWilktest分析數據正態性，非正態分布定量資料用中位數（上、下四分位數）表示，左右眼渾濁指數比較采用符號秩和檢驗，P<005為差異有統計學意義。8個劑量組之間的渾濁指數比較用H秩和檢驗，并采用Bonferroni法進行兩兩對比，P<005/比較次數（005/C28=00018）為差異有統計學意義。用Spearman秩相關分析左右眼渾濁指數與體質量的相關性，P<005為差異有統計學意義。

結果

一、大鼠體質量變化

我們每天造模前對大鼠進行體質量稱量并記錄，計算各組第30日時總的體質量增長率，見圖1，可見E和F組的體質量增長率最高，說明在一定的半乳糖濃度閾值下，其體質量增長速度與注射半乳糖量的大小有關，注射劑量越小，大鼠的生長發育程度越好；C、D與G、H組的注射濃度較高，體質量增長率低于其余濃度組。以3 d為一時間段計算各組體質量增長率，見表1，可以看出C～H組的體質量均在3～6 d這個時間段增長速度最快，A組在15～18 d，B組在6～9 d體質量增長速度最快。

二、各組大鼠晶狀體渾濁指數

裂隙燈觀察直至30 d時，A、B、C、D、E、F、G、H的白內障渾濁情況。按之前提到的標準進行記錄和統計換算，我們把同一只大鼠的左右眼指數取平均后得到渾濁指數結果如圖2所示。各組內左右眼渾濁指數比較差異無統計學意義（P均>005）。AE組，BF組， CG組， DH組的渾濁指數，即添加半乳糖水喂養與單純腹腔注射形成的白內障組間無明顯差異（P>00018）， 其余各組之間的渾濁指數的差異具有統計學意義（P<00018）。指數增長變化率如表3所示。第30日時， A組處于2b級， B組處于4級， C組處于2a級， D組處于3級， E組處1a級， F組處于2a級， G組處于 1c級， H組處于3級，各組大鼠第30日時白內障的渾濁情況見圖3。表2與表3相比可知，白內障渾濁加重的時間均出現在體質量迅速增長之后。說明隨著半乳糖的刺激，大鼠晶狀體的渾濁指數也隨體質量的增加而增加，體質量的增長與渾濁指數增長秩相關系數rs=098（P<005）。我們發現除E組外，低劑量組（A、C、G）75%于第9日時才出現1a級輕度的早期白內障改變，而高劑量組（B、D、H）75%基本是在第3日就出現1a級改變，F組25%于第9日開始出現1a級改變，且渾濁程度發展較低劑量組更為迅速。其余統計各級出現的時間點見表4。

討論

WHO組織在1999年提出的“視覺2020”行動，旨在2020年前根治全球可避免盲，防治中首先提到的即是白內障盲，響應“視覺2020”，降低視力損害的患病率，讓更多的人避免致盲或復明是醫學事業的目標之一[8]。有臨床觀察表明，糖尿病患者較非糖尿病患者發生白內障的風險較高，且時間較早。目前，滲透壓改變學說引起糖尿病患者晶狀體發生渾濁得到了眾多學者的認可[9]。當血糖濃度過高，過多的糖經多元醇通路代謝轉化成山梨醇及果糖，這些物質因不易透過晶體囊膜而在晶狀體堆積，使晶狀體內滲透壓增高，晶體吸水膨脹，最后引發白內障的形成。

常用糖尿病性白內障模型建立方法主要有：靜脈或腹腔注射鏈脲佐菌（STZ）； 飼喂 D半乳糖；腹腔注射 D半乳糖；皮下注射D半乳糖；球后注射D半乳糖。STZ是最早用于研究糖性白內障模型的藥物，它易引起較高的死亡率，且因誘導的動物糖尿病白內障模型顯示白內障的進展較快，并不利于糖尿病性白內障的研究。D半乳糖：具有價格合適及穩定等優點。單純的D半乳糖喂養的價格昂貴，最重要的是不能保證每只老鼠攝取的劑量相當，我們認為此種方法易造成較大的實驗誤差。皮下注射、球后注射均可成功誘發白內障[1011]。但是我們認為，等同于腹腔注射的高劑量皮下注射，皮下注射吸收較腹腔慢，考慮到大鼠的耐受能力，我們沒有采用該種方法。球后注射的操作復雜，可能還會同時引起其他的眼部并發癥，且球后注射對眼球本身就是一種外傷刺激，我們認為，該種造模方法無法評估球后注射對誘發白內障的影響程度。腹腔注射方法簡易可行，因此曾經成為國內眼科學者廣泛使用的方法。在我們嚴格按照每只大鼠的體質量進行對應劑量的注射的情況下，我們本次研究發現，半乳糖腹腔注射的方法是準確可行的，并不是國外大部分學者認為的不能形成白內障，而死亡率也沒有余琛琳等[4]報道的50%那么高。而有些學者提到不用腹腔注射，用喂養法，因為大多數老鼠病情惡劣甚至死亡，并且模型非常不穩定[12]。實驗過程中，我們確實觀察到大鼠會出現多食、多飲、毛發粗糙無光澤、聳背等狀態，但一般精神狀態及活力良好。有資料表明，選日齡較小的大鼠造模較好，模型復制的成敗主要取決于大鼠的日齡，而與體質量無關。我們在前期實驗發現，對基礎月齡為3個月的大鼠進行腹腔注射，觀察至30 d時，未出現任何晶狀體的改變[13]。故此，我們選用了3周左右的大鼠作為建模對象。以往的文獻對半乳糖注射的劑量不確定，也沒有一個確切的標準，甚至有同一學者同年發表的兩篇研究相同藥物對白內障影響的文章中，所用的半乳糖劑量也不同，在文獻[14]中所用到的劑量為10 g/（kg·d），腹腔注射，而在文獻[15]中所用到的劑量為15 g/（kg·d），腹腔注射。而觀察到的結果幾乎相同。我們按文獻[16]中提到的方法，將等量的半乳糖溶于4 ml注射用生理鹽水并進行腹腔注射，然而我們預實驗中第一天按此方法造模的死亡率高達90%。給予的注射半乳糖劑量大小對半乳糖性白內障的形成也有明顯影響，據此，我們選用10 g/kg和15 g/kg劑量來制造動物模型。與陳曉光等[17]和李婧等[18]研究相同，前期我們發現30%濃度的半乳糖大鼠飲用后容易拒飲并脫水死亡，我們選用了10%的半乳糖飲用水作為輔助藥物，在驗證飼養是否有助于白內障形成的同時降低了成本。

這些學者在研究白內障模型時都未提及死亡率的問題，我們本次研究不僅有效的證明了腹腔注射半乳糖可以成功的建立白內障動物模型，也發現了降低動物死亡率的方法[1819]。本次實驗死亡率僅為2083%，造模成功率為7083%，是較穩定的半乳糖白內障動物模型。

通過多組濃度的實驗，可以看出在一定閾值范圍內，注射半乳糖的劑量越大、濃度越高，大鼠的體質量增長越快。結果也可以發現晶狀體開始出現渾濁的時間隨著體質量增長最高峰的出現而出現。我們可以看出除E組外，其余組均是從第3～9日開始出現白內障的渾濁。以往的文獻也表明，半乳糖注射產生赤道部水泡的時間大部分在3～5 d，而我們觀察到體質量增長速度最快的階段大部分在第3日，說明體質量增長和白內障的渾濁指數增長存在一定關系[20]。高濃度組渾濁指數：B>H>D，說明在高劑量半乳糖的作用下，加喝半乳糖飲用水對白內障的產生沒有正向作用。B組每日1次高濃度效果最佳。低濃度組渾濁指數：A>C>G，同樣說明了越高濃度的腹腔注射及半乳糖的飲用喂養，對大鼠本身是一種損傷刺激，A組每日1次低濃度形成白內障的效果佳。在D組和H組注射劑量相同，且D組加喝半乳糖飲用水的情況下，H組的渾濁指數大于D組。說明在高劑量半乳糖的作用下，加喝半乳糖飲用水對白內障的產生沒有正向作用。C組和G組在注射劑量相同的情況下，渾濁指數在9～15 d出現平臺期，且G組的平臺期更長，隨后才出現較大幅度的增長，可以看出C組在第10日加喝半乳糖飲用水，相比于G組產生白內障的效果更佳。

但是，B組和F組，很明顯地看出喝半乳糖與不喝半乳糖的差別。B、H、D、A組增長幅度最大。F、G組幾乎重疊在一起，說明每日1次高濃度與每日2次低濃度效果相當，甚至每日1次高濃度（F組）造模的效果略好一些。我們的A～D組選擇了國外大部分學者的方法，添加半乳糖飲食，但是在腹腔注射了一定量的基礎上，輔助添加半乳糖飲用水，用于判斷半乳糖喂養與單純腹腔注射兩種方式之間是否有抵消或促進白內障發展的相互作用。

考慮到大鼠對水合氯醛及戊巴比妥等藥物的耐受窗口較窄，我們的實驗注射劑量已經很大，如果再對大鼠進行麻醉或鎮靜容易誘導它們死亡，加之大鼠本身性情較溫順，所以我們采取直接抓取固定有活力的大鼠進行裂隙燈拍照觀察及記錄，避免了因麻醉導致的死亡，極大地降低了死亡率。但是本次研究還存在一些不足，由于這次研究的目的主要是觀察腹腔注射半乳糖是否能成功誘發白內障形成，故我們當時的目的只局限于是否能成功誘發白內障，疏忽了對血糖的監測，在以后進一步的實驗研究中，我們會進一步完善我們的實驗方案。另外，由于我們本次的實驗由2名助手輪流進行腹腔注射給藥，A為有經驗者，B為初學者，大鼠死亡的發生基本在B者注射給藥時，此種給藥途徑，特別是高劑量已經基本等量于大鼠的腹腔容積，故我們認為，腹腔注射的方式和方法尤為重要，應避免注射時扎到腹腔臟器。但是，在有這個實驗干擾因素的影響下，我們此次的研究較其他學者的研究降低了死亡率的基礎上，還保證了較高的造模成功率，于是我們認為，我們的方法可以為日后需要對不同時期白內障進行實驗研究的學者提供一個參考方案。

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（收稿日期：20180108）

（本文編輯：楊江瑜）