低咖啡堿茶樹育種研究進展

梁少茹，王曉，黨永超，付群英，趙豐華

（1.信陽市農業科學院，河南 信陽 464000；2.河南省豫南茶樹資源綜合開發重點實驗室，河南 信陽 464000）

咖啡堿（caffeine）是茶葉的特征物質之一，同時也是重要的滋味物質。茶葉咖啡堿含量通常在3%～5%之間，也常被看作是影響茶葉質量的一個重要因素。咖啡堿具有升高血壓、增加血液中的兒茶酚胺含量、增強血液中高血壓蛋白原酶的活力、提高血清中游離脂肪酸水平、利尿和增加胃酸的分泌等作用［1］。一般來講，正常人日常飲茶所攝入的咖啡堿含量，即使按茶葉含量最高值計算也在安全范圍之內。然而，由于咖啡堿的藥理功能，攝入過量會引起焦燥不安、失眠、血壓升高等癥狀，對人體健康產生不利影響。經研究，攝入過多咖啡堿，易誘發兒童多動癥［2］，誘發孕婦妊娠中毒癥并導致新生兒殘疾、使胃潰瘍患者潰瘍難于愈合、更年期婦女月經紊亂、中老年人缺鈣甚至骨質疏松［3］，誘發腦血栓或心肌梗塞［4］，引起高血壓和心率不齊［5-7］等不良反應。因此，部分人群如兒童、孕婦、更年期婦女、中老年人、胃潰瘍、心腦血管、神經衰弱及高血壓等疾病患者不適宜攝入。

目前日本、美國等一些國家對茶制品中咖啡堿含量已作出限量規定，但對低咖啡堿茶中咖啡堿含量沒有統一標準，歐美等一般要求咖啡堿含量低于0.5%，中國、日本將咖啡堿含量低于1%的茶葉稱為低咖啡堿茶［8，9］。為了滿足特殊人群的需求，近年來各類低咖啡堿茶的研究也越來越引起研究者的興趣。降低茶葉中的咖啡堿含量目前主要從兩個方面來進行：一是通過一定的加工工藝，利用物理化學等手段脫除茶葉中的咖啡堿；另一條途徑是進行茶樹育種研究，培育出低咖啡堿含量的茶樹新品種。

國內外運用物理化學等方法脫除茶葉咖啡堿的研究一直不斷，如：用熱水浸提法脫除茶鮮葉中的咖啡堿［10-12］，利用工業乙醇［13］、三氯甲烷［14］等有機溶劑萃取茶葉或茶提取液中的咖啡堿，或運用超臨界CO2萃取［15-17］、大孔樹脂吸附法［18］提取咖啡堿，此外還有減壓升華法［19］、茶多酚水溶液浸提法［20］、微生物降解法［21，22］等手段降低茶葉咖啡堿含量。國內外目前也有一些咖啡堿脫除工藝和裝備的專利面世［23］。然而一直以來，關于脫除茶葉咖啡堿的加工工藝研究并不深入，目前為止尚未研究出既保持茶葉原有風味又安全高效的方法。從長遠看，加強茶樹育種研究，培育咖啡堿含量低的茶樹品種是最為有效且經濟安全的方法。

低咖啡堿茶樹育種的途徑主要有常規育種和利用生物技術尤其是基因工程開發茶樹新品種。

1 常規育種選育低咖啡堿茶樹

通過常規雜交育種選育低咖啡堿茶樹新品種是降低茶葉咖啡堿含量經濟有效的方法之一。

1.1 低咖啡堿茶樹種質資源的鑒定及評價

我國農業行業標準規定低咖啡堿茶樹特異種質資源咖啡堿含量不超過1.5%［24］。選育低咖啡堿茶樹品種，天然低咖啡堿茶樹種質資源的篩選、鑒定及評價尤為重要。

經過一系列的研究與選擇，目前已篩選出部分低（無）咖啡堿茶樹種質資源。早在20世紀80年代日本就已開始低咖啡堿茶樹新品系選育，并選出8份咖啡堿含量低于2%的茶樹品系［25］。目前，日本等國已鑒定出咖啡堿低于0.5%的茶樹育種材料［26］。我國低咖啡堿茶樹資源非常豐富，科研工作者不斷加大對特異種質資源的篩選力度，獲得一些低咖啡堿育種材料，尤其是近年來獲得了多個咖啡堿含量低于1.5%的茶樹育種新材料［27］，低咖啡堿育種已經取得良好進展。

20世紀80年代，張宏達等［28］在廣東龍門發現一種天然無咖啡堿的茶樹品種資源即可可茶（毛葉茶），分析表明可可茶含有4.7%可可堿而不含咖啡堿；陳盛相等［29］從四川聯江良種場、蒙頂山70份資源中篩選出2份咖啡堿含量春季低于2%的資源；唐一春等［9］通過對勐海國家茶樹種質分圃100份茶樹資源農藝性狀、生化成分及加工品質的鑒定評價，篩選出2份（即金廠大樹茶、大壩大樹茶）咖啡堿含量分別為0.06%、0.07%的野生型特異茶樹種質資源，但經分析這兩種資源與國家級良種云抗10號相比經濟性狀、生化成分含量均較差；張凱等［30］對川渝地區野生大茶樹資源進行調查研究發現1份低咖啡堿茶樹資源黃山苦茶，咖啡堿含量只有0.323%；劉聲傳等［31］對貴州省25個縣（市）境內53份樹齡約100年以上的野生茶樹資源的主要生化成分進行測定評價和遺傳多樣性分析，篩選出1份咖啡堿含量為1.8%的資源，接近低咖啡堿資源含量；蘇會等［32］對豫南地區115份茶樹種質資源進行遺傳變異分析，其咖啡堿變異系數為28.57%，并篩選出咖啡堿含量為0.13%的種質資源1份；段志芬等［33］對云南景洪市49株野生古茶樹進行低咖啡堿資源篩選，結果為低咖啡堿含量（≤1.50%）特異資源有 14 份，咖啡堿含量極低的（≤0.70%）有4份，即曼加坡坎3號大茶樹、光明水庫2號大茶樹、大寨5號大茶樹和曼加坡坎6號大茶樹，占總資源數的8.16%。這些低咖啡堿特異種質資源的篩選與發現，可為選育低咖啡堿茶樹品種奠定基礎。

1.2 低咖啡堿茶樹品種常規選育研究進展

利用已篩選出的低咖啡堿種質資源，并通過一定的育種技術研究與試驗，目前低咖啡堿茶樹育種已取得一些進展。

日本用篩選出的咖啡堿含量低的品種與藪北種雜交獲得8個咖啡堿含量低于1.7%的單株后代，最低的為1.42%，且通過對茶樹和茶樹近緣種進行種間雜交試驗，選育出多個咖啡堿含量在1.5%以下的單株［25］。葉創興等［34］對毛葉茶進行育種研究，現已選出純種的可可茶，為進行優良無性系品種選育打下基礎。廣東省農業科學院茶研究所和中山大學合作，以野生南昆山白毛茶為親本雜交選育出一批可可茶新品系，其中“可可茶l號”和“可可茶2號”的咖啡堿含量幾乎為零［35］。南京農業大學運用多項現代技術，雜交選育出一種低咖啡堿茶樹品種“蘇安特”，使茶葉中咖啡堿含量從4%左右降低為0.79%，而茶葉中原來的其它一些營養成分保持不變［36］。Ogino等［26］在“Cha Chuukanbohon Nou 6”（雜交組合Camellia taliensis×C.sinensis的后代）天然雜種中鑒定出咖啡堿含量很低但可可堿含量很高的單株2個。安徽農業大學在茶樹與油茶嫁接選育低咖啡堿茶樹品種研究中發現，采用地上部根頸嫁接法，以多抗香品種茶樹作接穗，嫁接后的苗木中咖啡堿含量由3.08%降低到2.01%，因此可以認為茶樹與油茶嫁接是降低茶樹咖啡堿含量的有效方法之一［37］。

1.3 常規育種的缺點與面臨的困難

常規育種選育低咖啡堿茶樹品種有一些缺點與困難，使得選育新品種進展緩慢。面臨的困難主要有：一是茶樹屬木本植物，生育周期長，常規育種需要20年左右時間，年限較長，耗費人力、物力、財力較大；二是缺乏天然可利用的優質低咖啡堿育種材料，現階段篩選的低咖啡堿種質資源一般品質性狀較差，產量較低；三是篩選的有些低咖啡堿野生種質資源與栽培茶樹雜交易發生不孕或胚發育不完全現象，難以獲得雜種后代，即使獲得低咖啡堿雜交種，也大多品質不佳，難以大范圍推廣應用；四是咖啡堿含量屬于數量性狀，易受栽培條件、外界環境條件的變化而不穩定，需多次重復鑒定，效率較低。鑒于此，近年來，利用傳統育種方法選育低咖啡堿茶樹雖取得一些進展，但無論是可可茶，還是選育的其它低咖啡堿茶樹資源均未獲得大規模的開發利用。目前為止，還未通過常規育種選育出適應市場的高產優質品種。

2 應用基因工程降低茶樹咖啡堿研究

基因工程育種是指有目的地將外源基因導入植物并使之整合、表達和遺傳，修飾原有植物遺傳物質、改造不良的園藝性狀而進行的新品種育種方法。基因育種可以快速實現定向選擇育種目標，大大縮短育種周期，利用基因工程可以在較短時間內培育低咖啡堿茶樹，而且不會影響轉基因植株的其它生化成分，因此利用基因工程來培育低咖啡堿茶樹品種是一條新途徑。

2.1 茶樹體內咖啡堿合成途徑中相關酶的基因分離與克隆

關于咖啡堿的合成途徑大多是通過對咖啡果和茶樹的研究得來的，經國內外學者研究證明，咖啡堿在各種含咖啡堿植物中合成的基本路徑基本一致［38］。研究者在大量研究基礎上，將咖啡堿的合成途徑分成兩個部分：核心途徑和供體途徑［39］。

2.1.1 核心途徑 咖啡堿合成的核心途徑主要分為四個步驟，包括甲基化轉移酶催化的三次甲基化作用和核糖核苷水解酶催化的一次脫核苷作用［40］，具體途徑為：黃嘌呤核苷（xanthosine）→7-甲基黃嘌呤核苷（7-methylxanthosine）→7-甲基黃嘌呤（7-methylxanthine）→可可堿（theobromine）→咖啡堿［41］。N-甲基轉移酶（NMT）是咖啡堿合成過程中的重要酶。

在咖啡堿合成的核心途徑中，第一步甲基化反應是由7位N-甲基轉移酶催化完成。Negishi等［42］從茶樹葉片中獲得7-NMT（黃嘌呤核苷N-甲基轉移酶），并證明它是催化第一步反應的酶。Mizuno等［43］從咖啡樹中克隆出該酶全長編碼基因cDNA CmXRS1（AB034699），其在大腸桿菌中表達的重組蛋白顯示N-甲基轉移活性。第二步和第三步甲基化反應分別由3位和1位N-甲基轉移酶催化完成。Suzuki等［44］從茶葉提取物中分離出這兩種酶，分別催化可可堿、咖啡堿的反應生成，并證明這兩種酶具有相似性質。Kato等［45，46］從茶葉嫩葉中分離出咖啡堿合成酶（CS），利用RACE技術克隆出該酶編碼cDNA，TCS1（AB031280），并通過體外表達和功能驗證證實TCS1為編碼茶樹咖啡堿合成酶的基因。

由7-甲基黃嘌呤核苷合成7-甲基黃嘌呤由核糖核苷水解酶催化完成。Negishi等［47］曾從茶樹粗酶液中檢測出核糖核苷水解酶的活性并純化出部分該酶，但關于該酶的基因克隆及相關的蛋白表達未見報道。

2.1.2 供體途徑 在供體途徑中，有多種來源可以最終合成黃嘌呤核苷，從而為核心途徑提供起始甲基受體。目前至少發現存在四條不同的合成途徑，分別是：嘌呤環從頭合成途徑、腺嘌呤核苷酸（AMP）降解途徑、鳥嘌呤核苷酸（GMP）降解途徑以及S-腺苷甲硫氨酸（SAM）循環途徑［39，48］。

茶樹黃嘌呤核苷主要來源于S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM合成酶是咖啡堿合成過程中的重要酶之一。馮艷飛等［49］首次從茶樹葉片中克隆茶樹S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶基因cDNA，sAMS（Gen Bank登錄號：AJ277206，DDBJ登錄號：AB041534），所得基因序列長1 303 bp，編碼394個氨基酸，該基因的克隆為今后咖啡堿代謝的調控研究奠定了基礎。IMPDH（次黃嘌呤核苷酸脫氫酶）是催化次黃嘌呤核苷酸（IMP）轉化為黃嘌呤核苷酸（XMP）的關鍵酶。Keya等［50］首次克隆得到IMPDH基因編碼cDNA，TIDH（EU106658），并證明其在咖啡堿合成途徑中起關鍵作用。AMP脫氨酶催化腺嘌呤核苷酸（AMP）→次黃嘌呤核苷酸（IMP）反應。魏艷麗等［51］首次通過從茶樹全器官轉錄組文庫中獲得的AMP脫氨酶的部分EST序列成功克隆出茶樹AMP脫氨酶cDNA的全長（GenBank登錄號：AGJ84350.1），通過對不同物種的AMP脫氨酶氨基酸比對發現，茶樹的AMP脫氨酶與其它植物克隆出的AMP脫氨酶基因有較高的同源性，并含有相似的蛋白質保守活性位點。

目前，催化黃嘌呤核苷酸（XMP）→xanthosine（黃嘌呤核苷）的核苷酸酶、鳥嘌呤脫氨酶（guanine deaminase，GDA）在茶樹葉片中也已被檢測到［52，53］，但是關于它們完整的基因序列還沒有相關報道。

2.2 茶樹體內咖啡堿合成途徑中相關酶及基因研究利用

根據已獲得的咖啡堿合成途徑中相關酶的基因序列信息，不同地區研究者已展開一系列研究與探討。

余有本［54］從龍井43中克隆了茶樹咖啡堿合成酶的cDNA編碼區序列及cDNA全長序列；李遠華等［55］采用原位雜交技術研究，結果表明茶樹咖啡堿合成酶基因（TCS1）mRNA表達主要存在于含葉綠體多的柵欄組織。陳麗萍等［56］在紅山茶、油茶和可可茶基因組中PCR擴增TCS1部分片斷，結果僅在可可茶中獲得目的片斷，并推測其核苷酸序列的差異可能是導致南昆山毛葉茶NMT基因活性改變、影響茶樹體內咖啡堿代謝的原因之一；許煜華等［57］在英紅9號中分離出12條核苷酸序列高度相似的NMTs；金基強等［58］利用長片段PCR法和側翼序列克隆技術分離了白葉一號多個NMTs的基因組DNA（gDNA）全長并初步明確了它們的基因結構和序列差異。這些研究表明茶樹存在著一個與嘌呤堿合成相關的NMT基因家族。李金等［59］研究10個茶樹品種咖啡堿合成途徑中3個關鍵酶基因（TCS1、TIDH、SAMS）秋季的表達量，并與咖啡堿含量進行相關性分析，結果表明，與TIDH、SAMS相比，TCS1對茶樹咖啡堿的合成起到更為重要的作用。周晨陽等［60］對茶樹TIDH DNA序列進行了克隆，在檢測95份茶樹核心種質資源的TIDH核苷酸多態性及咖啡堿含量后進行關聯分析，找到2個與咖啡堿含量顯著相關的單核苷酸多態（single nucleotide polymorphism，SNP）位點；魏艷麗［61］用檢測48個茶樹品種得到的TCS1序列進行單核苷酸多態性與對應的咖啡堿含量關聯分析，發現995位點AA與CC基因型對應的咖啡堿含量存在顯著差異（P＜0.05），該位點的CC基因型為低咖啡堿茶樹品種的優勢基因。劉玉飛等［62］對673份茶樹資源的TCS1等位變異進行鑒定，克隆了一個新的TCS1稀有等位變異TCS1g，其在“龍陵17”中具有一定的表達水平且其表達蛋白僅具有可可堿合成酶活性，推測決定TCS1g僅具有可可堿合成酶活性的關鍵位點是第221位氨基酸殘基。這些研究可為今后從基因組水平揭示不同資源間咖啡堿合成代謝差異的機理、利用特定基因選擇低咖啡堿茶樹種質資源、分子標記輔助育種等奠定基礎。

2.3 基因工程在低咖啡堿茶樹育種中的探索應用

目前，咖啡堿合成過程中重要相關酶如咖啡堿合成酶、SAM合成酶、次黃嘌呤核苷酸脫氫酶等基因的全長cDNA序列已被克隆，不同地區研究者試圖通過基因工程來培育低咖啡堿茶樹并進行一些探究。

反義RNA技術和RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術在植物基因工程育種中得到廣泛應用，利用反義RNA技術和RNAi技術可以通過定向抑制咖啡堿合成過程關鍵酶基因的表達來培育低咖啡堿茶樹品種。目前，其它植物已有通過該技術獲得轉基因植株來降低咖啡堿含量的報道。Ogita等［63］利用RNAi技術成功構建了咖啡的轉基因植株，并證實轉基因植株咖啡中可可堿合成酶CaXMT1和咖啡堿合成酶CaDXMT1基因的表達均受到抑制，從而使可可堿和咖啡堿合成量有所下降。張廣輝等［64］成功構建了茶樹咖啡因合成酶基因RNA干涉表達載體。余有本［54］構建了茶樹咖啡堿合成酶基因反義RNA的表達載體和RNAi表達載體，并通過農桿菌葉盤轉化法導入到了茶樹愈傷組織，經鑒定TCS反義基因已整合到抗性愈傷組織的基因組中并得到正常表達。石冠華［65］構建了咖啡堿合成酶基因干涉表達載體，以龍井-43組培苗葉片為轉化受體，通過根癌農桿菌將其導入植物組織中，并優化了根癌農桿菌轉化茶樹葉片組織的條件。Mohanpuria等［66，67］將含咖啡堿合成酶基因（CS）片段的RNAi載體分別導入茶樹子葉的胚性愈傷組織和種子萌發一個月的茶樹幼苗根系，成功獲得含該載體的轉基因植株，經測定轉基因植株的咖啡堿和可可堿含量分別比對照低44%～61%和46%～67%。這證實了利用基因工程技術降低茶樹咖啡堿的可能性及基因沉默的穩定性。

2.4 基因工程在茶樹育種中所面臨的難題

基因工程為低咖啡堿茶樹育種開辟了新途徑，但距離獲得理想的茶樹新品種還有大量的工作要做。

目前，茶樹遺傳轉化領域技術并不成熟。農桿菌、基因槍等方法單獨或聯合介導的茶樹遺傳轉化均有不少研究，但獲得轉基因茶樹卻依然非常困難。由于茶樹是多年生植物，茶樹中多酚類物質含量高，造成培養時愈傷組織易褐化、難以分化，轉基因低咖啡堿茶樹研究長期以來停留在載體構建和轉化后抗性愈傷組織篩選的階段。總的來說，迄今為止還未建立起完善的茶樹遺傳轉化體系，這也是基因工程在茶樹育種中的瓶頸問題。

此外，利用反義RNA技術和RNA干擾技術通過目前已知的咖啡堿合成關鍵酶基因進行探索與研究，雖然有些試驗基因的表達得到抑制，轉基因植株中咖啡堿含量也有所降低，但效果不夠理想。現階段茶樹體內咖啡堿合成過程相關酶類的編碼基因并未完全獲得，每種酶類所起到的作用也并為研究透徹，咖啡堿在茶樹體內的合成與分解、運輸機制并未完全了解，因此獲得其余關鍵酶的編碼基因對低咖啡堿茶樹育種有重要影響。

3 低咖啡堿茶樹育種展望

我國茶樹種質資源豐富多樣，近年來各地研究者對低咖啡堿茶樹種質資源考察收集、保存、保護和鑒定取得一定進展，但距離培育出理想的低咖啡堿茶樹品種還有很長的路要走。在今后工作中，繼續加強優異低咖啡堿茶樹種質資源的收集與優良基因的鑒定，并利用現代手段從中發掘咖啡堿合成酶稀有等位基因資源，探析其遺傳機制，能夠為茶樹新品種選育、茶樹遺傳改良提供物質基礎與理論依據；同時應把現代分子育種與常規育種相結合，縮短育種年限，提高育種效率。

目前，與咖啡堿合成相關酶的基因克隆取得很大進展，但仍有酶類基因編碼并未獲得，因此有必要開展研究掌握更多的基因信息，進而更加深入研究咖啡堿代謝機制與遺傳機制；可運用關聯分析研究，尋找與咖啡堿含量具有緊密遺傳連鎖的分子標記探究茶樹咖啡堿含量的影響因素；用現代技術手段明確其咖啡堿合成過程中酶的基因結構和核苷酸變異，從基因組水平剖析茶樹咖啡堿的遺傳機制，為茶樹低咖啡堿育種奠定基礎。此外，積極開展茶樹遺傳轉化體系的研究，建立能夠穩定遺傳親本優良特性的高效的茶樹遺傳轉化體系，也是開展利用基因工程培育低咖啡堿茶樹必須解決的難題。

除此之外，采用人工誘導突變創造低咖啡堿突變體，結合生化標記和分子標記技術進行輔助育種，也是低咖啡堿茶樹育種的重要思路與方法。