種公豬精液攜帶繁殖障礙相關病原調查

楊永能楊培昌*陶鑫趙謙楊超汪向民

（1，云南省楚雄州動物疫病預防控制中心 675000；2，云南農業大學 650201）

豬繁殖障礙性疾病是一類主要導致妊娠母豬流產、產死胎、弱胎、木乃伊胎及公豬生精功能下降等為主要特征的疫病，該類疫病的存在給養豬業帶來巨大經濟損失。隨著養殖業的進一步發展，多種病因引起的混合感染讓豬繁殖障礙病因越來越復雜，防治越來越困難。其中，豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS)、豬瘟 (CSF)、豬圓環病毒 2型(PCV-2)、豬細小病毒 (PPV)、偽狂犬病 (PR)、豬乙型腦炎 (JE)均可引起豬群繁殖障礙性疾病，給養豬業造成巨大經濟損失。

豬人工授精技術的推廣與應用使疫病經精液傳播的風險大大提高。所以，公豬健康及其精液品質安全對生豬疾病防控起關鍵作用[1]。為全面了解楚雄州種豬精液攜帶繁殖障礙相關病毒性病原狀況，此次調查采集27個種豬精液供應點93份不同種公豬精液樣品進行病原學檢測，現將檢測情況及結果報告如下。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

精液樣品采集自：2017年8月至2018年2月楚雄州九縣（市）共27個種豬精液供應點，共計93份不同種公豬精液樣品。

1.1.2 實驗儀器

超凈工作臺、-20℃低溫冰箱、各種量程的移液槍、電子天平、速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、電泳槽、全自動凝膠成像分析系統、手提式高壓蒸汽滅菌壓力鍋、恒溫水浴振蕩器。

1.1.3 實驗試劑

RNAiso Plus Total RNA、Bioteke細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、 RI Enzyme Mix、 2×ES Reaction Mix、 2×Trans Taq HiFiPCR Super Mix、異丙醇、75%乙醇、瓊脂粉、TAE緩沖液、雙蒸水、氯仿等。

1.1.4 PCR引物合成

參照相關序列使用primer premier 5.0軟件設計所用引物，并在Blast上進行比對后送往上海生物工程有限公司合成。具體引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取

使用RNAiso Plus Total RNA和細胞/組織基因組DNA提取試劑盒對樣品分別進行RNA和DNA的提取，提取過程嚴格按照說明書進行。

1.2.2 目的基因片段擴增

（1）豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)、豬乙型腦炎病毒（JEV）和豬瘟病毒（CSFV）RT-PCR擴增。將上述提取出來的樣品RNA利用特異性引物對其進行RT-PCR擴增，反轉錄體系如下：2×ES Reaction Mix(含 10×RT Buffer， dNTPs)5ul， EasyScriptTMⅡ RT/RI Emzyme Mix(含Rnase Inhibitor，反轉錄酶)0.5ul，下游引物1ul，模板RNA 3.5ul，反應體系為10ul。將配制好的體系置于 42℃反應30min，之后85℃反應5min。反轉錄產物置于4℃保存備用。 PCR 擴增體系為： Mix(含 10×PCR buffer， dNTPs，TransTaq酶) 12.5ul，dH2O 10.5ul，上游引物和下游引物各 0.5ul，反轉錄產物（cDNA）1ul，總反應體系為 25ul。PRRSV擴增反應條件為：94℃ 3min；94℃ 1min，65℃1min，72℃ 1min，40個循環；72℃ 5min。JEV擴增反應條件為： 94℃ 5min； 94℃ 40s， 56℃ 40s， 72℃ 40min， 35個循環；72℃ 5min。CSFV第一輪擴增反應條件為：94℃ 5min；94℃ 30s， 53℃ 45s， 72℃ 50s， 34 個循環； 72℃ 5min。 將所得到的第一輪產物稀釋300倍后進行第二輪擴增，反應條件為：94℃ 5min； 94℃ 40s， 56℃ 40s， 72℃ 40s， 34 個循環； 72℃5min。取10ul PCR擴增產物配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠（含0.2%EB）孔中，并在100V電壓下進行40min的電泳，在凝膠成像系統上觀察結果，并拍照。

（2）豬圓環病毒 2型（PCV-2）、豬細小病毒（PPV）和偽狂犬病毒（PRV）PCR擴增。將上述提取出來的樣品DNA利用特異性引物對其進行PCR擴增，PCR擴增體系為 ： Mix(含 10×PCRbuffer， dNTPs， TransTaq 酶 )12.5ul，dH2O 10.5ul，上下游引物各0.5ul，DNA 1ul，總反應體系為 25ul。PCV-2擴增反應條件為：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 40s，72℃ 40s，35次循環；72℃ 7min。PRV擴增反應條件為： 94℃ 5min； 94℃ 30s， 59℃ 35s， 72℃ 40s， 35個循環；72℃ 5min。PPV擴增反應條件為：94℃ 5min；94℃1min， 60℃ 1min， 72℃ 1min， 30次循環； 72℃ 7min。 取10ul PCR擴增產物配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠（含0.2%EB）孔中，并在100V電壓下進行40min的電泳，在凝膠成像系統上觀察結果，并拍照。

表1 6種病毒引物序列表

2 實驗結果

2.1 種公豬精液六種繁殖障礙性病毒性病原檢測結果

對來自云南楚雄州九縣 (市)地區共計93份精液樣品分別進行豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環病毒2型（PCV-2）、偽狂犬病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）和豬乙型腦炎病毒（JEV）檢測，結果為93份樣品中檢測出了8份豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）陽性8份，陽性率為8.6%(8/93)；檢測出豬瘟病毒（CSFV）陽性0份，陽性率為0%(0/93)；檢測出豬圓環病毒 2型（PCV-2）陽性18份，陽性率為19.35%(18/93)；檢測為偽狂犬病毒（PRV）陽性1份，陽性率為1.08%(1/93)；檢測出豬細小病毒（PPV）陽性0份，陽性率為0%(0/93)，檢測出豬乙型腦炎病毒（JEV）陽性0份，陽性率為0%(0/93)。具體見表2。

2.2 6種繁殖障礙性病毒性病原檢測結果電泳圖

詳見圖1～圖6電泳圖。

3 討論

3.1 PCR方法可作為精液中攜帶病原最快捷準確的檢測方法之一

PCR技術具有簡單、快捷、特異性好、靈敏度高的優點，作為目前疫病監測的重要方法之一，被廣泛應用于病毒診斷和流行病學調查。此次采用PCR與RT-PCR方法對云南楚雄地區多個供精點的精液攜帶繁殖障礙相關病原進行檢測，在實驗過程中PCR檢測方法快捷，結果準確，靈敏，可靠。

3.2 精液中的病源傳播不容小視

近年來，隨著豬人工授精技術的廣泛推廣與應用，種豬精液的品質安全對養殖業疫病防控至關重要。科學研究表明，病毒可以通過公豬精液傳染給豬群，其中危害最大的疫病是病毒性疾病，這類疫病主要包括豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS)、豬瘟 (CSF)、偽狂犬病 (PR)、豬圓環病毒2型 (PCV-2)、乙型腦炎 (JE)、豬細小病毒 (PPV)等等[2]。有資料表明，種公豬在感染豬繁殖與呼吸系統綜合癥病毒(PRRSV)后第4天即可從精液中檢測到PRRSV病毒顆粒，而種公豬外表不表現出任何臨床癥狀[3]。這些疾病主要導致妊娠母豬繁殖障礙，而這些疫病不但能通過水平和接觸傳播，還能通過公豬精液垂直傳播[4]，攜帶病原的種公豬通過精液將病原傳給母豬，母豬妊娠后可將自身感染的病原通過胎盤屏障傳染給胎兒，造成新生仔豬感染，進而造成疫情擴散與流行。因此，加強對供精站點種豬精液帶毒檢測，發現并及時淘汰帶毒種公豬，銷毀帶毒精液，從而及時消滅疫病傳染源，對防范和控制豬繁殖障礙性疫病的傳播與流行具有重要作用。

表2 6種繁殖障礙性病毒性病原檢測結果

圖1 豬圓環病毒2型（PCV-2）電泳圖（部分）

圖2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）電泳圖（部分）

圖3 偽狂犬病毒（PRV）電泳圖（部分）

圖4 豬瘟病毒（CSFV）電泳圖（部分）

圖5 豬細小病毒（PPV）電泳圖

圖6 豬乙型腦炎病毒（JEV）電泳圖

3.3 加強對供精站點公豬精液的監管刻不容緩

從調查結果可以看出，檢測的93份精液樣品中27份精液樣品攜帶繁殖障礙相關病原，綜合陽性率高達29.03%。其中豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）陽性8份，陽性率為8.6%；豬圓環病毒2型（PCV-2）陽性18份，陽性率為19.35%；偽狂犬病毒（PRV）陽性1份，陽性率為1.08%。尚未發現混合感染的情況。檢測結果陽性帶毒公豬通過精液傳播疫病的風險較大，如不及時淘汰帶毒公豬，可能造成疫病傳播與流行。因此，相關監管部門應定期加強對供精站點公豬精液的監管刻不容緩。

3.4 公豬精液帶毒與豬發病的關系

此次采集精液的種公豬均來自各供精站點品種優良、外觀健康未發現任何發病的種公豬，但通過種豬精液樣品檢測結果可知，部分種豬存在攜帶PRRSV、PCV-2、PRV，攜帶病原的種公豬并未表現出發病癥狀，很難被肉眼識別。由此說明，公豬精液帶毒與豬只發病不存在直接聯系。因此，定期對種豬精液采用實驗室方法進行檢測尤為重要。