日照市豬A型口蹄疫檢測與疫情風險分析

劉峰

（山東省日照市動物疫病預防控制中心 276800）

日照市位于蘇魯交界的黃海之濱，為國家膠東半島免疫無口蹄疫緩沖區。為了解全市豬A型口蹄疫疫情風險，2018年3月日照市根據全省統一部署開展了對養殖場、屠宰場和無害化處理廠的專項調查。通過深入養豬場查看和流行病學調查發現，豬群整體狀況良好，無口蹄疫癥狀。在未免疫豬A型口蹄疫疫苗的豬場采集了豬血樣60份，進行豬A型口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測，未檢測到A型口蹄疫抗體；采集了屠宰場、無害化處理廠豬淋巴結和扁桃體各60份，進行豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR試驗，結果均為陰性。綜上所述，日照市目前未發現豬A型口蹄疫病例，但如果疏于日常管理也可能導致疫情發生。

1 檢測

1.1 豬A型口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測試驗

檢測依據∶GB/T18935-2003。

1.1.1 樣品概述

采集自未免疫豬A型口蹄疫疫苗的豬場，豬只前腔靜脈采血，離心收集血清60份，液體、澄清、淺黃色。

1.1.2 主要儀器

全波長酶標儀（MultiskanGO，美國賽默飛）、電熱恒溫干燥箱（GZX_9140，上海博迅）、超純水儀（Cascada，美國PALL）， 移液器（Biohit， 芬蘭百得）。

1.1.3 診斷試劑

蘭州獸醫研究所生產的口蹄疫A型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，批號：20170906103-2。

1.1.4 檢驗室環境

溫度：25℃，濕度：55%。

1.1.5 檢測時間

20180323-20180324。

1.1.6 主要操作步驟

（1）抗原抗體反應：在U型血凝板上將待檢血清從1∶16倍比稀釋至1∶128，然后每空加稀釋的病毒抗原50ul，封板，4℃過夜。（2）ELISA板洗5次，將抗原抗體混合物50ul移至ELISA板上，37℃1h。（3）洗5次，加入50ul豚鼠抗血清，37℃30min。（4） 洗5次， 加入50ul酶結合物，37℃30min。（5） 洗5次， 加入50ul底物， 37℃15min。（6） 加入50ul終止液，立即在450nm波長讀取光吸收值。

1.2 豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測試驗

檢測依據∶GB/T27528-2011。

1.2.1 樣品概述

采集自屠宰場、無害化處理廠的豬淋巴結和扁桃體各60份，固體、組織。

1.2.2 主要儀器

II級生物安全柜（AC24，新西蘭）、熒光RT-PCR儀（7500， 美國 ABI）、 移液器（Biohit,芬蘭百得）。

1.2.3 診斷試劑

北京生科生產的豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR試劑盒，批號： 20170901。

1.2.4 檢驗室環境

溫度：25℃，濕度：55%。

1.2.5 檢測時間

2018年3月25日至2018年3月26日。

1.2.6 主要操作程序

（1）樣品處理：稱樣品1g,用手術剪刀剪碎混勻后取0.05g于研磨缽中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續研磨，待勻漿后轉至1.5ml滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清200ul置于1.5ml滅菌離心管中。

（2）病毒模板RNA提取：收集200ul樣品或陰陽性對照，加入1.5ml滅菌離心管中；加200ulBufferV-L，漩渦振蕩混合均勻，靜置5min；75ulBufferV-N，A漩渦振蕩混合均勻，12000×g離心5min；將上清液轉移到新的2ml離心管中，加300ul異丙醇，上下倒置6～8次，混合均勻；將植被管置于2ml離心管中，取上一步的混合液移入植被管，6000×g離心1min；將植被管置回到2ml離心管中，12000×g離心1min，將植被管置于清潔的1.5ml離心管中，在植被管膜中央加60ul-BufferTE，室溫靜置1min，12000×g離心1min，洗脫RNA。

（3）反應液配制：反應體系按照RT-PCR反應液15ulTab酶0.25ul進行配制，每個反應管中加入上述反應體系15ul，加樣10ul，放入儀器中。

（4） 熒光 RT-PCR 反應： 42℃30min； 92℃3min； 92℃10s， 45℃30s， 72℃1min， 5個循環； 92℃10s， 60℃30s， 40個循環，熒光收集設備在第四階段每次循環退火延伸時進行。

2 結果

根據結果判定標準，被檢測的60份樣本中未檢測到A型口蹄疫抗體，詳見表1。

根據結果判斷標準，120份被檢測樣本中未發現口蹄疫病毒，詳見表2。

3 分析

本次檢測受檢測時間和樣本數量限制，代表廣泛性不是很強。但通過對調查問卷中的飼養情況、調運檢疫情況、疫苗接種情況統計和養豬場的地理位置、疾病防治、消毒、用藥、發病史、發病數、環境衛生狀況分析，結合實驗室檢測數據，可以認為日照市未發現豬A型口蹄疫病例，但存在可能導致疫情發生的諸多不安全隱患。

表2 豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測試驗結果

（1）個別養殖戶管理不規范，檔案記錄不全。豬有病不能及時發現，死豬后不能及時無害化處理，疫情不按時上報。特別是對豬口蹄疫危害認識不足，及時免疫不規范。

（2）個別散養戶豬場消毒設施設備不全，車輛人員隨便出入，場區不能按時消毒。

（3）新引進的豬只不進行隔離觀察和口蹄疫檢測，存在引進陰性帶毒個體的風險性。

（4）大部分養殖場不能及時進行免疫抗體檢測，不能主動進行特種疫病凈化。

（5）畜禽交易、屠宰、產品加工等場所的排污、環境消毒等環節，缺少有效監管。

4 建議

（1）大力宣傳口蹄疫的危險性和危害性，強化以消毒滅源為主的生物安全防范措施，抓好養殖場日常管理。

（2）繼續做好牛羊O/A型和豬O型口蹄疫疫苗強制免疫工作，并及時補免。

（3）定期開展實驗室抗體監測和疫病檢測，及時發現隱患，加強動物疫情測報與信息交流。

（4）加強檢疫監督。強化產地檢疫、屠宰檢疫和調運監管，嚴防輸入性疫病的發生。

（5）通過優惠政策扶持養殖場主動進行特種疫病凈化，提高病死畜禽的無害化處理率，及時消滅疫病傳染源。