紹興地區腫瘤生物樣本庫的建設和管理

李玉紅 丁倩男 王勛英 郭航遠

312000 紹興市人民醫院麻醉科（李玉紅），醫學研究中心（丁倩男），科教處（王勛英），心內科（郭航遠）

腫瘤為高發病率和高病死率的疾病，統計資料表明，每10萬人有286例患癌，一生中有22%的概率患癌；每10萬人有181例患癌死亡，人的一生中有13%的概率死于癌癥[1]。據紹興市疾病調查顯示[2]，惡性腫瘤是紹興市居民生命安全的第一殺手，其危害程度日趨上升；腫瘤治療給社會和家庭帶來沉重的經濟負擔。研究惡性腫瘤的發病機制已成為當今醫藥學研究的熱點[3]。目前實驗室基礎研究是惡性腫瘤研究的重要手段，而足夠數量的腫瘤標本是實驗研究的前提和基礎，所以系統化收集腫瘤患者的標本，是腫瘤實驗研究的必備條件[4]。為了充分保護和合理利用紹興地區高發腫瘤[3]的樣本資源，為將來腫瘤研究提供合適數量，優質的腫瘤標本，為縮短課題研究周期，促進腫瘤研究，在紹興市人民醫院建設紹興地區高發腫瘤生物標本庫。腫瘤生物樣本庫充分利用紹興地區最大的綜合性三甲醫院醫療優勢，合理收集手術切除的腫瘤組織和患者血液標本，并對其進行低溫冷凍保存，同時建立規范的信息系統保存樣本信息和患者的臨床信息，為研究者開展腫瘤研究工作提供標本資源和服務平臺。

1 材料和方法

1.1 硬件系統建設

1.1.1 用房建設 包括標本存儲室、標本處置室和配套的公共實驗室和辦公室。標本存儲室用于標本的存儲；標本處置室用于組織標本和血液標本的預處理；配套的公共實驗室用于存儲生物樣本的質量控制以及使用生物樣本開展科學研究。醫院手術室清潔走廊設置采樣間，采樣間擁有良好的通風系統，配置采樣臺、采樣器具、照相設備和便攜式液氮罐；辦公室安裝樣本庫信息管理系統和溫度監控系統。樣本存儲室由紹興市人民醫院醫學研究中心庫房改造而成，面積約50m2，建設要求如下：（1）強電：要求每臺冰箱均配16A三角插座，每2臺冰箱配置1個30A空氣開關，連接4mm2電線；每臺5匹空調配4mm2電線，需1個30A空氣開關。注意預留環境、設備、視頻監控的線路和插座。需要備用電源接入。（2）弱電：超低溫冰箱區建議預留2個網絡接口，供環境、設備監控使用或留作樣本出入庫電腦聯網備用。每個網絡接口周圍預留強電插座（10A）。（3）地面處理：用環氧樹脂處理，達到防潮、防濕、防靜電的效果。（4）通風系統：本區域按每小時保證換氣至少8次計算，至少需要排風量1 200m3/h。（5）消防系統：配備煙霧報警及基礎消防設施，避免使用水噴淋和干粉滅火，建議使用二氧化碳滅火。

圖1 樣本庫存儲室平面圖

1.1.2 設備建設 冷鏈樣本存儲設備包括：-80℃深低溫冰箱、液氮罐、-20℃冰柜、4℃試劑保存柜，以及以1:1原則備用深低溫冰箱，確保停電或者設備故障維修時生物樣本庫依舊能夠正常運行；輔助設備包括：血液標本預處理所需的通風柜或者生物安全柜、低溫高速離心機、常溫離心機、高壓滅菌器、制冰機等；完成常規分子生物實驗所需設備，如核酸提取儀、PCR儀、全波段酶標儀、全波長分光光度計以及全能型成像系統等。

1.2 軟件建設

1.2.1 倫理系統的建立 醫院原有醫學倫理委員會承擔樣本庫涉及的倫理問題，樣本庫建設作為紹興市重大平臺項目，該項目建設方案遞交倫理委員會討論并通過（倫理編號為：2017017），每一例患者熟悉標本采集和回訪過程，簽署同意書，同意手術切除組織樣本、血液樣本捐贈以及接受出院后回訪。

1.2.2 信息系統建設 購買腫瘤標本庫一套信息管理軟件，軟件預留鏈接端口，為實現腫瘤樣本庫管理軟件與醫院信息管理系統（hospital information system，HIS）、醫院檢驗系統（Laboratory Information Management System，LIS）以及影像歸檔和通信系統（Picture Archiving and Communication Systems，PACS）等逐步對接，樣本庫管理軟件可以自主設置不同字段，其主要內容有：患者一般資料、標本一般資料、標本存放位置資料、標本使用情況、標本質控信息、標本廢除信息以及綜合查詢等。

1.2.3 監控系統建設 所有冷鏈設備均安裝溫度監控系統，同時安裝斷電報警系統。

1.2.4 建設各項制度和標準操作文件 結合國際生物和環境樣本庫協會（The Institute for Social Behavioral and Economic Research，ISBRE）最佳實踐[5]及中國醫藥生物技術協會生物樣本庫標準[6]，制定標準化建設制度，涵蓋樣本信息管理、安全管理、質量管理、設施建設、標準化操作流程等，指導腫瘤生物樣本庫標準化建設。

1.2.5 專業人員的培訓 招聘標本庫工作專業人員2名，首先在醫院病理科接收病理取材專業培訓，確保癌組織、癌旁組織及正常組織的區分；其次送往具有成熟經驗的生物樣本庫中心集中培訓，培訓患者知情同意過程、組織或者血液樣本采集流程，以及樣本庫信息化管理、質量控制等。專職人員專職從事標本收集、處理、質量控制和標本管理等工作。

1.3 標本采集 腫瘤生物樣本庫標本采集流程為：（1）患者或者家屬知情同意，主管醫生判斷是否符合納入標準；對符合納入標準的病例，主管醫生與患者家屬以及患者本人討論，告知參加標本庫捐贈程序、患者需要承擔任務和以及可能的風險、患者在此過程中享受的權益等。患者和家屬愿意捐贈組織和血液樣本，由主管醫生、患者或者其代理人共同簽署知情同意書；（2）主管醫生填寫組織和血液標本采集通知單，通知標本庫工作人員。（3）標本庫工作人員每天查閱手術通知單，對當天納入手術患者打印標簽貼，準備凍存管，患者入手術室，手術室護士通知標本庫工作人員采集血標本；腫瘤組織切除之前，手術室護士通知標本庫工作人員采集組織標本，當腫瘤組織直徑＞1cm，采集部分腫瘤組織標本，其余送病理檢查；腫瘤組織直徑＜1cm，全部送病理檢查，放棄留取標本。（4）組織標本立刻置于液氮速凍，同步將標本信息錄入標本庫管理系統，包括患者住院號、初步診斷、大體標本切除時間等。（5）標本速凍30min后置于－80℃深低溫或者－196℃液氮罐凍存（見圖2）。

圖2 樣本采集流程圖

1.3.1 組織標本采集 組織標本為手術切除大體標本或者穿刺活檢標本，每例患者組織標本包括癌組織、癌旁組織和遠端正常組織。每管組織量0.5g左右，分割成0.2～0.5cm的組織塊，癌組織、癌旁組織以及正常組織各分3～5管保存。每一例手術切除大體標本拍照，并記錄熱缺血、腫瘤部位和范圍等資料。

1.3.2 血液標本的收集 每次患者采集空腹血標本5～8ml，詳細記錄抽血時間和抽血量。血液標本分成不抗凝和EDTA抗凝2管，在室溫放置1h后開始離心（3 000r/min，10min），離心結束后吸取上層血清或血漿、抗凝管下層血細胞，按每管200～300μl液體分裝，統一編號，存放入－80℃深低溫冰箱。

1.4 生物樣本庫建設的質量控制 納入標本捐贈患者的知情同意書簽署所占的比例；每一個組織標本采集記錄熱缺血時間；術后定期隨訪患者所占的比例；隨機方法按照1/1 000的比例抽取部分樣本，采用蘇木素和伊紅染色評估組織樣本取材的準確性；RNA抽提使用Prepito RNA Tissue 250 Kit（德國Perkin Elmer公司）。利用分光光度計（美國Nano Drop2000）測定A260/A280比值。

2 結果

2.1 樣本采集和信息錄入 自紹興地區高發腫瘤生物樣本庫建設以來，以紹興地區高發腫瘤組織、血液收集為主，截止至2015年5月已收集218例患者的組織和（或）血液標本，其中手術腫瘤組織標本1 875份、血液標本2 008份、糞便標本122管以及骨髓標本14管（見表1），與標本相對應的臨床信息完整度達100%。

表1 紹興地區高發腫瘤標本庫收集腫瘤標本種類和數量（份）

圖3 腫瘤患者組織采集熱缺血時間（m in）

2.2 組織樣本熱缺血時間 218例腫瘤患者組織標本熱缺血時間平均值為（12±3）min，見圖 3。

圖4 組織標本RNA純度檢測A260/A280

2.3 組織樣本RNA純度測定 抽取10份組織標本，A260/A280值為 1.92±0.02，見圖 4。

3 討論

經手術切除的腫瘤標本是現代腫瘤研究的重要材料，是不可再生資源。自1990年來，腫瘤標本進行科學化管理和合理利用引起世界各地腫瘤研究者的重視，在此基礎上腫瘤生物標本庫逐漸建立和完善。目前，國內外眾多知名腫瘤研究單位也紛紛建立腫瘤生物標本庫，如ISBRE[7]、泛歐洲生物樣本庫與分子生物資源研究中心（Biobanking and Molecular Research Infrastructure，BBMRI）[8]、美國國家癌癥研究所（National Cancer Insti－tute，NCI）[9]。2004年美國癌癥基金會資助天津腫瘤醫院建立組織庫[10]，2005年北大腫瘤醫院建立北京大學臨床腫瘤學院標本庫[11]，2006年紐約中華醫學基金會資助中山大學腫瘤醫院建立腫瘤資源庫[12]。

紹興地區地處江南水鄉，氣候潮濕，食物易霉變，紹興地區居民飲食偏愛霉干菜、霉豆腐等食物；另外，紹興地區工業發達，尤其印染工業據國內前列。上述原因可能導致該地區胃腸道腫瘤、肺癌以及血液系統癌癥高發。針對該地區高發腫瘤建立腫瘤生物樣本庫，通過積極采集和合理存儲常見腫瘤組織、血液等標本，對其進行規范科學化的管理和質量監測，為基礎和臨床研究提供大量的高質量生物樣本資源。紹興市人民醫院有穩定的腫瘤標本來源，可以保證腫瘤生物樣本庫庫存標本數量不斷補充。紹興市腫瘤生物樣本庫有2名專職工作人員負責標本的收集、處理、凍存等日常工作，并制定了一系列管理制度，技術路線和操作流程已經基本趨于規范。院領導的頂層設計、對標本庫重要性的高度認識以及大力支持是標本庫建設成功的關鍵因素；標本庫主管負責人與各科室包括信息科、病理科以及各臨床科室的協調配合是標本庫順利開展的重要保證；另外，收集合格的標本則取決于標本采集和標本保存過程以及臨床資料的完整性。

首先是標本采集，組織標本采集的關鍵包括準確定位標本取材部位，標本采集人員需要經過病理取材專業培訓，才能確保癌組織、癌旁組織及正常組織的區分。利用常規病理檢測方法對留取標本進行病理組織學鑒定，若其中的腫瘤成分超過75%則認為質量良好，如不足65%則應從研究中剔除[13]。筆者考慮病理組織學鑒定將在樣本出庫，為研究者提供樣本時檢測。為了保證組織標本質量，避免DNA、RNA和蛋白質的降解，既往研究提示嚴格控制標本離體時間（熱缺血）30min以內將組織置于冷鏈中儲存[14－15]；另外工作人員操作過程中避免標本污染（自身污染和環境污染）以確保標本質量，同一標本不同部位的取材必須更換刀片，取材避開壞死部位[16]。筆者腫瘤生物樣本庫建設過程中，記錄每例患者組織樣本熱缺血時間，結果顯示均控制在20min以內。

其次是標本保存，低溫凍存被公認是組織長期保存的有效方法之一，其原理是通過降低細胞代謝率起到保護組織的作用[17]。目前，國內外大型腫瘤組織庫以采用－80℃深低溫冰箱儲存為主，對于低溫環境下生物大分子活力保存，很多學者進行了一些列研究，張佳年等[18]納入上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院上海消化外科研究所腫瘤樣本庫2002至2006年手術切除胃癌標本，探索低溫技術對腫瘤生物大分子的影響，結果發現組織樣本低溫保存5年范圍內，其DNA分子的完整性與質量均未受影響；RNA與蛋白質分子在低溫保存1～2年內尚不影響癌基因表達的分析結果，但低溫保存3年或以上的標本中RNA及蛋白質均有不同程度降解。該研究團隊進一步研究納入0～10年的手術切除胃癌組織標本，結果提示：組織標本長期低溫凍存對DNA影響最小，超過5年組RNA和大分子量蛋白質降解較多，但是小分子量蛋白質保存完好[19]。RNA分子容易被廣泛存在于細胞內、皮膚、唾液、汗水及周圍環境中的RNA酶所降解，液氮保存是保存RNA活性最理想的方法，當溫度降至液氮溫度時，細胞組織中所有的生物化學、生物物理過程均處于停止狀態[20]，但限于空間及經費等原因，大型液氮罐儲存或者液氮冰箱難以推廣普及。

高質量的標本，提供高質量的DNA和RNA，對下游分析結果起至關重要的作用，標本庫的質量控制歸根結底是生物大分子的質量控制[21]?；蚪MDNA質量檢測主要包括：基因組DNA片段大小的確定，DNA濃度和純度測定3方面。檢測技術有：瓊脂糖凝膠電泳（確定片段大?。?，根據條帶判斷其完整性[22]；不同成分的樣品會有不同的吸光度：260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，280nm則是蛋白和酚類。一般用A260/A280來檢驗DNA和RNA的純度，純DNA的A260/A280比值約為1.8左右，而純RNA約為2.0左右。過低表明有蛋白質污染[23]。對于組織RNA的質量分析主要依據28S與18S的比值進行，比值在2認為質量好，比值＜1則認為RNA已降解。28S和18S是真核生物rRNA（核糖體RNA）的兩個亞基，在體內含量較多。RNA提取過程中可能發生各種突進的降解，28S/18S即為衡量提取的RNA完整性的指標，如果28S/18S為2，表明所提取的RNA完整性較好，基本無降解發生。本研究中，抽取10管組織，提取RNA，紫外分光光度計A260/A280，結果顯示均在1.9。尚未進行DNA和蛋白質量以及其它質控檢測，另外還需要進行管家基因和目的基因的擴增以判斷腫瘤標本質量的優劣[24]，從而促進臨床研究質量和水平的提升[25]。

綜上所述，醫學臨床研究與基礎研究的發展總是離不開多方合作，腫瘤生物標本庫在充分利用自身資源合理發展的同時，也在尋找機會與省內外以及國內外專業腫瘤標本庫建立合作關系，利用與省內外知名科研機構建立起的良好的科技合作機制，通過加強與知名研究機構的合作交流，加快建設具有地區特色的腫瘤研究交流平臺。