固相萃取/高效液相色譜法對(duì)火龍果中手性苯醚甲環(huán)唑的分離測(cè)定

張利強(qiáng)，邢淑蓮，林麗云，林 玲，葉劍芝，楊春亮*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(湛江)，廣東 湛江 524002；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湛江實(shí)驗(yàn)站，廣東 湛江 524002)

物質(zhì)與其鏡像不能重疊的性質(zhì)稱為手性(Chirality)，是自然界普遍存在的基本屬性。由于生物體中許多生化反應(yīng)在手性環(huán)境條件下發(fā)生，使得對(duì)映體雖具有相同的理化性質(zhì)，但在毒性、生物活性及與手性的生命系統(tǒng)作用時(shí)常表現(xiàn)出明顯差異[1]。如20世紀(jì)60年代典型的“反應(yīng)停事件”，沙利度胺(Thalidomide)的R-型對(duì)映體具有抑制妊娠反應(yīng)活性，而S-型對(duì)映體具有嚴(yán)重的胚胎毒性和致畸作用[2]。三唑類手性農(nóng)藥種類眾多且應(yīng)用廣泛，但由于其對(duì)映體存在不同的殺菌活性和毒理效應(yīng)而被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)列為潛在的手性致癌物[3-4]。因此，建立測(cè)定手性農(nóng)藥對(duì)映體含量的新方法，對(duì)于明確對(duì)映體活性和毒理效應(yīng)，客觀全面了解手性農(nóng)藥在環(huán)境中的確切行為具有重要研究意義。

圖1 手性農(nóng)藥苯醚甲環(huán)唑的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of chiral pesticide difenoconazole*denoted chiral center

苯醚甲環(huán)唑4個(gè)手性對(duì)映體的拆分和測(cè)定與僅含1個(gè)手性中心的其他三唑類農(nóng)藥相比難度較大。有關(guān)苯醚甲環(huán)唑等三唑類農(nóng)藥對(duì)映體的拆分方法主要有毛細(xì)管電泳法[8-10]、超臨界流體色譜法[11-13]和高效液相色譜法[14-17]。液相色譜法因無(wú)需樣品氣化，柱容量高，分離條件溫和，且該儀器技術(shù)日趨成熟，已成為三唑類農(nóng)藥手性拆分的主流方法[18]。上述儀器方法[8，13-15]對(duì)其他三唑類農(nóng)藥均能實(shí)現(xiàn)較好的基線分離，而對(duì)苯醚甲環(huán)唑其中2個(gè)對(duì)映體(2R,4R)-苯醚甲環(huán)唑與(2S,4S)-苯醚甲環(huán)唑卻不能完全分離或分離時(shí)間較長(zhǎng)[16]。本研究以火龍果為代表，建立了一種石墨化炭黑/氨基固相小柱凈化，直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)鍵合手性柱(IF-3)進(jìn)行拆分的高效液相色譜法。該方法分離時(shí)間較短，分離效果好，靈敏度高。適合推廣用于火龍果等水果中手性農(nóng)藥苯醚甲環(huán)唑含量的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AD高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器(日本島津公司)；PL-602L電子天平(美國(guó)梅特勒-托利多公司)；24N-EVAP112型氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)；MS-3振蕩器(德國(guó)IKA公司)；立式大容量高速離心機(jī)(日本日立公司)。

苯醚甲環(huán)唑外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)；正己烷、丙酮、乙腈、乙醇(色譜純，德國(guó)默克公司)；氯化鈉(優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；Sep-Pak Carbon/NH2固相萃取柱(500 mg/500 mg，6 mL，美國(guó)Waters公司)；Chiralcel IF-3(4.6 mm×250 mm，3 μm)，填料為直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價(jià)鍵合3 μm硅膠(日本大賽璐化學(xué)工業(yè)公司)，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。火龍果樣品從市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件手性色譜柱：Chiralcel IF-3(4.6 mm×250 mm，3 μm)，填料為直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價(jià)鍵合3 μm硅膠。流動(dòng)相為正己烷-乙醇(92∶ 8，體積比)，使用前經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，手動(dòng)搖勻。流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣量為60 μL。所有樣品至少平行測(cè)定2次。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取25 mg苯醚甲環(huán)唑外消旋標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，得到1 000 mg/L的外消旋苯醚甲環(huán)唑儲(chǔ)備液，即對(duì)映體的質(zhì)量濃度均為250 mg/L。于4 ℃冰箱中避光保存，臨用前恢復(fù)至室溫并搖勻。按樣品前處理過(guò)程將空白樣品處理后得到空白基質(zhì)提取液，用此基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度，得到一系列不同濃度的苯醚甲環(huán)唑基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3樣品前處理方法選取新鮮的火龍果，帶皮切成小片，用打碎機(jī)磨成果漿。分別稱取火龍果試樣10.00 g于3個(gè)50 mL離心管中(1、2、3號(hào))，1號(hào)離心管中不添加外消旋苯醚甲環(huán)唑標(biāo)液作為空白；2號(hào)離心管中添加0.20 mL 20 mg/L的外消旋苯醚甲環(huán)唑標(biāo)液作為樣品1；3號(hào)離心管中添加1.40 mL 20 mg/L的外消旋苯醚甲環(huán)唑標(biāo)液作為樣品2。各離心管的液體混勻后作為模擬樣品，用于回收率實(shí)驗(yàn)。

分別加入20.0 mL乙腈于上述離心管中，混勻，加入4.0 g氯化鈉，于2 000 r/min渦旋1 min，再以8 000 r/min離心5 min，吸取上層乙腈清液氮吹至約1 mL。用4.0 mL乙腈-甲苯(3∶ 1，體積比，下同)預(yù)先淋洗石墨化炭黑/氨基小柱，至液面近干時(shí)，將提取液加入到小柱中，再向濃縮管中加入2.0 mL乙腈-甲苯(3∶ 1)，渦旋后一并加入到小柱。然后用10.0 mL上述混合溶劑洗脫，洗脫液氮?dú)獯蹈桑谜和槎ㄈ葜?.00 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1手性色譜柱的選擇目前關(guān)于苯醚甲環(huán)唑手性拆分的研究較少，文獻(xiàn)報(bào)道中采用的手性色譜柱有纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(Chiralcel OD柱)[13，15]、纖維素-三(4-甲基苯基甲酸酯)(Chiralcel OJ柱)[15，17]和纖維素-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)[7](Chiralcel IB-3柱)。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)資料，考察了Chiralcel OD柱(4.6 mm×250 mm，3 μm)、Chiralcel OJ柱(4.6 mm×250 mm，3 μm)和Chiralcel IF-3(4.6 mm×250 mm，3 μm)對(duì)苯醚甲環(huán)唑的拆分效果。結(jié)果顯示，(2R,4R)-苯醚甲環(huán)唑、(2S,4S)-苯醚甲環(huán)唑、(2R,4S)-苯醚甲環(huán)唑在OJ柱上完全分不開(kāi)，在OD柱上未基線分離，且用時(shí)較長(zhǎng)(超過(guò)50 min)，而在IF-3柱上，除(2R,4R)-苯醚甲環(huán)唑、(2S,4S)-苯醚甲環(huán)唑不能完全分離外，其他對(duì)映體均能實(shí)現(xiàn)完全分離，且用時(shí)較短。實(shí)驗(yàn)最終選擇IF-3手性柱進(jìn)行分離。

2.1.2流動(dòng)相組成的優(yōu)化分別配制體積比為90∶ 10、92∶ 8和95∶ 5的正己烷-乙醇3種流動(dòng)相，考察了乙醇用量對(duì)分離效果的影響。4個(gè)對(duì)映體的保留時(shí)間和分離度見(jiàn)表1。結(jié)果表明，流動(dòng)相中乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，洗脫速度最快；而乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)雖分離度最好，但洗脫時(shí)間較長(zhǎng)。為兼顧洗脫速度和分離度，選用正己烷-乙醇(92∶ 8)為流動(dòng)相。

表1 不同流動(dòng)相中苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w的保留時(shí)間及分離度Table 1 Retention times and resolutions of difenoconazole enantiomers in different mobile phases

*number(1-4) denoted were(2R,4R)-difenoconazole，(2S,4S)-difenoconazole，(2R,4S)-difenoconazole and(2S,4R)-difenoconazole，respectively

2.1.3流速的選擇分別考察了流動(dòng)相流速為0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min時(shí)對(duì)洗脫時(shí)間、柱前壓力和分離度的影響。實(shí)驗(yàn)得到RS12分別為1.12、1.08、1.04、1.00，RS23分別為2.05、2.03、1.99、1.94；RS34分別為3.03、3.01、2.94、2.91。由于一針樣品所需時(shí)間取決于最后一個(gè)色譜峰，因此重點(diǎn)考察了(2S,4R)-苯醚甲環(huán)唑的保留時(shí)間，分別為37.31、27.90、24.60、20.93 min。柱前壓力分別為6.0、7.5、9.1、10.7 MPa。由于較大的柱前壓力會(huì)對(duì)色譜柱耐用性造成影響。因此綜合考慮分析時(shí)間、分離度和柱子損傷等因素，選擇流速為1.0 mL/min。

2.1.4進(jìn)樣量的選擇分別考察了進(jìn)樣量為20、30、40、50、60、70、80 μL時(shí)對(duì)分離效果的影響。結(jié)果顯示，4個(gè)對(duì)映體的響應(yīng)值均隨進(jìn)樣量的增大而增加，但分離度逐漸減小。綜合考慮響應(yīng)值和前兩個(gè)對(duì)映體間的分離度，同時(shí)避免樣品量增加對(duì)色譜的污染，實(shí)驗(yàn)最終選擇進(jìn)樣量為60 μL。

圖2 外消旋苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of difenoconazole enantiomers peak number(1-4) were(2R,4R)-difenoconazole，(2S,4S)- difenoconazole，(2R,4S)-difenoconazole and (2S,4R)-difenoconazole，respectively

綜上，確定優(yōu)化后的手性分離色譜條件為：手性色譜柱Chiralcel IF-3(4.6 mm×250 mm，3 μm)，流動(dòng)相為正己烷-乙醇(92∶ 8)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為60 μL。在優(yōu)化色譜條件下對(duì)苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w進(jìn)行拆分，可在35 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離(圖2)。

2.2 溶劑效應(yīng)的考察

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同氮吹濃縮程度的上機(jī)液出峰質(zhì)量存在明顯差別，因此考察了乙腈和正己烷分別作為復(fù)溶溶劑時(shí)對(duì)出峰質(zhì)量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈作為復(fù)溶溶劑時(shí)，對(duì)檢測(cè)信號(hào)干擾較大，基線明顯不穩(wěn)定，且苯醚甲環(huán)唑4個(gè)對(duì)映體的峰形展寬變差，前2個(gè)對(duì)映體不能完全分離；而正己烷作為復(fù)溶溶劑時(shí)基線平穩(wěn)，雜峰較少，苯醚甲環(huán)唑4個(gè)對(duì)映體的峰形對(duì)稱尖銳，基本全部分離。因此，樣品檢測(cè)時(shí)需嚴(yán)格控制氮吹濃縮過(guò)程，以避免乙腈殘留對(duì)出峰質(zhì)量的影響。

2.3 基質(zhì)作用的考察

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w(10 mg/L)的峰形明顯好于試劑標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的基質(zhì)作用進(jìn)行了考察，試劑標(biāo)準(zhǔn)和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按“1.2.2”配制。結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度較低時(shí)，試劑標(biāo)準(zhǔn)和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中苯醚甲環(huán)唑4個(gè)對(duì)映體的峰形和峰面積基本相同；當(dāng)試劑標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度增至20 mg/L時(shí)，柱子過(guò)載造成峰形變差，4個(gè)對(duì)映體無(wú)法分開(kāi)，而基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度即便增至40 mg/L，4個(gè)對(duì)映體仍能基本全部分離，且峰形對(duì)稱尖銳。因此在樣品測(cè)定時(shí)選擇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校準(zhǔn)定量，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用空白樣品提取液適當(dāng)稀釋外消旋苯醚甲環(huán)唑儲(chǔ)備液，使其質(zhì)量濃度分別為0.40、1.0、4.0、10、40 mg/L，由于外消旋苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液中4個(gè)對(duì)映體含量相同，各對(duì)映體的質(zhì)量濃度分別為0.10、0.25、1.0、2.5、10 mg/L。將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行液相色譜分離測(cè)定。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w的質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)4個(gè)對(duì)映體單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別上機(jī)測(cè)定比對(duì)，確認(rèn)出峰先后順序?yàn)椋?2R,4R)-苯醚甲環(huán)唑、(2S,4S)-苯醚甲環(huán)唑、(2R,4S)-苯醚甲環(huán)唑、(2S,4R)-苯醚甲環(huán)唑。回歸方程分別為：(2R,4R)-苯醚甲環(huán)唑：y1=50 198x1+37 324，r1=0.999 5；(2S,4S)-苯醚甲環(huán)唑：y2=53 528x2+9 923，r2=0.999 5；(2R,4S)-苯醚甲環(huán)唑：y3=84 607x3+114 966，r3=0.998 7；(2S,4R)-苯醚甲環(huán)唑：y4=81 929x4+31 206，r4=0.999 4。

上述結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w在0.10～10 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按3倍信噪比(S/N=3)確定單個(gè)對(duì)映體的檢出限為0.025 mg/L。

表2 火龍果樣品中苯醚甲環(huán)唑的平均回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=4)Table 2 Average recoveries and relative standard deviations for difenoconazole in dragon fruit sample(n=4)

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

分別稱取10.00 g火龍果樣品3份，其中1份做空白，另2份添加不同量的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.3”方法進(jìn)行前處理后測(cè)定，平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見(jiàn)表2。以加標(biāo)樣品信噪比S/N≥10時(shí)空白樣品的加標(biāo)濃度確定方法的定量下限(LOQ)，得到LOQ為0.10 mg·kg-1(見(jiàn)表2)。結(jié)果顯示，該方法回收率較好，在0.4、2.8 mg/kg加標(biāo)水平下，4個(gè)對(duì)映體的平均回收率分別為83.7%～99.3%和86.4%～91.6%，RSD分別為1.3%～7.2%和1.4%～3.1%。火龍果樣品空白和添加外消旋苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液后的色譜圖見(jiàn)圖3。

3 結(jié) 論

本文利用直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)鍵合手性柱(IF-3)實(shí)現(xiàn)了對(duì)手性農(nóng)藥苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w的拆分。通過(guò)優(yōu)化分離條件，成功拆分了苯醚甲環(huán)唑4個(gè)對(duì)映體，并建立了快速測(cè)定火龍果中苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w殘留量的新方法。該方法分離時(shí)間較短，分離效果好，靈敏度高，適用于火龍果等水果中手性農(nóng)藥苯醚甲環(huán)唑含量的測(cè)定。