基于多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物的攪拌棒吸附萃取/高效液相色譜法測定食用油中黃曲霉毒素

李珺沬，律 濤，劉 彥，李 程，王新宇，馬海燕

(河北醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，河北 石家莊 050017)

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)主要是黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[1]，是一種劇毒物質(zhì)，被世界衛(wèi)生組織(WTO)的癌癥研究機構(gòu)(IARC)劃定為天然存在的Ⅰ類致癌物[2]。黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2(AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)(分子結(jié)構(gòu)式如圖1)普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中[3]，然而，由于AF化學(xué)結(jié)構(gòu)極其穩(wěn)定，普通的食物處理方法很難將其消除[4]，所以一旦AF進入人類食物鏈，即對人體健康造成極大的危害。目前，全世界每年約有25%的食物可能受到AF的污染[5]，尤其用于食用油生產(chǎn)的主要原料花生、葵花籽、大豆、芝麻等，在貯藏、運輸、生產(chǎn)和加工等各環(huán)節(jié)均易受到黃曲霉菌侵染[6-7]，導(dǎo)致AF中毒事件屢見報道[8]，而食用油中AF的檢測方法研究卻非常有限。因此，研究建立食用油中AF的檢測方法對于保障食品安全具有重要意義。

目前，AF的檢測方法主要有薄層色譜法[9]、熒光分光光度法[10]、酶聯(lián)免疫法[11-14]、免疫親和柱凈化/高效液相色譜法[15-18]等。然而薄層色譜法的特異性差、靈敏度低；熒光分光光度法只能檢測AF總量，不能實現(xiàn)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的單獨測定;酶聯(lián)免疫法的特異性強、分析速度快，但穩(wěn)定性較差，假陽性較多；而免疫親和柱法依賴于與抗體的結(jié)合，可能產(chǎn)生抗體交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致測定結(jié)果不準確。

石墨烯是碳原子以SP2雜化軌道組成的具六角型蜂巢晶格結(jié)構(gòu)的二維納米材料[19]，可經(jīng)氧化制得具有含氧官能團的氧化石墨烯[20-21]。氧化石墨烯表面上的官能團能與不同的試劑反應(yīng)得到功能化石墨烯，其可作為優(yōu)越的吸附材料用于樣品的前處理研究[22-25]。近年來，受貽貝足絲蛋白5(Mfp-5)超強黏附特性的啟發(fā)，貽貝仿生化學(xué)也逐漸成為材料學(xué)、化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點[26]。多巴胺可作為Mfp-5的模型分子，通過復(fù)雜的氧化-自聚和組裝，黏附于有機或無機固體材料表面，并能夠通過化學(xué)鍵的作用與吸附材料形成聚多巴胺-吸附材料復(fù)合物涂層，從而為吸附材料在樣品前處理領(lǐng)域的研究開辟了更加廣闊的前景[26-27]。

本研究基于貽貝仿生化學(xué)制備多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物固相萃取材料，并將其鍵合在含有磁子的聚四氟乙烯材質(zhì)的攪拌棒上，利用攪拌棒吸附萃取/高效液相色譜/熒光檢測器對食用油中的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2進行分析。該方法具有高效、靈敏、重現(xiàn)性好等特點，為食用油中痕量AF的分析提供了有效手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與樣品

L-6200A高效液相色譜儀(日本Hitachi公司)；2475熒光檢測器(美國Waters公司)；柱后衍生系統(tǒng)(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋(鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司)；HGC-24型氮吹儀(天津恒高技術(shù)有限公司)。

AFB1、AFB2、AFG1和AFG2標準溶液(美國Sigma公司)；氧化石墨烯水分散液(濟寧利特納米技術(shù)有限責任公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia Scientific公司)；鹽酸多巴胺(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；碘(濟南蕭試化工有限公司)；所用其它試劑均為分析純，實驗用超純水由美國Millipore公司Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

實驗所用食用油購自石家莊市某市場。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18色譜柱(5 μm，250 mm × 4.60 mm)；流動相：甲醇-乙腈-水(10%磷酸調(diào)至pH 3.5，體積比3∶ 3∶ 5)；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL；流速：0.8 mL/min；熒光檢測：λex=360 nm，λem=450 nm；衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生試劑流速：0.3 mL/min；衍生溫度：70 ℃。

1.3 混合標準溶液的配制

分別精密量取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2標準溶液適量于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均為50 μg/L的混合標準儲備液。將混合標準儲備液用甲醇逐級稀釋，配制成含AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別為10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 μg/L的系列混合標準溶液，于4 ℃避光保存。

1.4 SBSE攪拌棒的制備及表征方法

將含磁子的攪拌棒置于含2 g/L多巴胺的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.5)中，于30 ℃磁力攪拌水浴鍋中緩慢勻速攪拌12 h，取出攪拌棒，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥30 min，將攪拌棒置于2 g/L氧化石墨烯水分散液中，于65 ℃磁力攪拌水浴鍋中反應(yīng)12 h，取出攪拌棒，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥30 min。重復(fù)以上實驗步驟3次，得到具有一定多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物涂層厚度的SBSE攪拌棒，該攪拌棒能夠批量制備，每個攪拌棒可重復(fù)使用20次。

應(yīng)用掃描電鏡對SBSE攪拌棒上的涂層進行表征。將上述已涂層的SBSE攪拌棒置于甲醇中超聲清洗30 s，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥2 h，取出，采用離子噴鍍儀進行金離子鍍膜，于掃描電子顯微鏡下觀察，對SBSE攪拌棒涂層效果進行表征。

1.5 樣品前處理方法

精密量取食用油樣品1 mL于10 mL離心管中，加入甲醇-水(7∶ 3)溶液[28]5 mL，超聲提取10 min，以3 500 r/min離心5 min，精密量取上清液3 mL于西林瓶中，用水稀釋至10 mL。

將制備好的攪拌棒置于上述溶液中，在磁力攪拌水浴鍋中于50 ℃ 300 r/min萃取20 min，取出，于1 mL解吸溶劑甲醇中洗脫10 min，解吸溶液于45 ℃氮氣流下吹干，以0.1 mL流動相復(fù)溶，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 SBSE攪拌棒涂層效果的表征

通過掃描電鏡技術(shù)對SBSE攪拌棒的涂層效果進行表征。由圖2可見：未經(jīng)涂層的SBSE攪拌棒表面光滑(圖2A及插圖)，經(jīng)多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物涂層后的SBSE攪拌棒表面呈粗糙、褶皺形態(tài)(圖2B及插圖)，這種攪拌棒表面由光滑到粗糙、褶皺現(xiàn)象的變化是由于多巴胺聚合氧化石墨烯后能夠形成高度交聯(lián)的多孔性結(jié)構(gòu)所致。實驗結(jié)果還表明，多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物已成功聚合到攪拌棒上，形成了多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物涂層的SBSE攪拌棒。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1萃取溫度的優(yōu)化考察了萃取溫度在30～70 ℃范圍時SBSE對AF萃取效果的影響。結(jié)果表明：隨著萃取溫度的升高，4種AF的峰面積逐漸增大，當溫度為50 ℃時萃取效果最佳，之后繼續(xù)提高萃取溫度，各待測組分的峰面積逐漸減小。因此，本實驗選擇最佳萃取溫度為50 ℃。

2.2.2攪拌速度的優(yōu)化攪拌能夠加快溶液中待測組分的傳質(zhì)速率，縮短萃取時間。本實驗考察了不同攪拌速度(100、200、300、400、500 r/min)對萃取效果的影響。結(jié)果表明，當攪拌速度為300 r/min時，各待測組分的峰面積最大，萃取效果最佳。因此，本實驗選擇最佳攪拌速度為300 r/min。

2.2.3萃取時間的優(yōu)化考察了不同萃取時間(5、10、20、30、40 min)對萃取效果的影響。結(jié)果表明：隨著萃取時間的延長，各待測組分的峰面積逐漸增大，當萃取時間為20 min時，4種AF的峰面積達到最大值，之后繼續(xù)延長萃取時間，各待測組分的峰面積變化不明顯。因此，選擇最佳萃取時間為20 min。

2.2.4離子強度的優(yōu)化考察了體系中加入不同質(zhì)量分數(shù)(0、1%、2%、3%、4%)的NaCl對萃取效果的影響。結(jié)果表明，離子強度的變化對4種AF的萃取量有明顯影響，隨著NaCl加入量的增大，各待測組分的峰面積均呈下降趨勢。因此，本實驗選擇不添加NaCl。

2.2.5解吸時間的優(yōu)化解吸時間是影響待測組分回收率的重要因素。本實驗考察了不同解吸時間(2、5、10、15、20 min)對萃取效果的影響。結(jié)果表明，隨著解吸時間的增加，4種AF的峰面積逐漸增大，當解吸時間達到10 min時，萃取效果最佳，之后繼續(xù)增加解吸時間，各待測組分的峰面積趨于平緩。因此，本實驗選擇最佳解吸時間為10 min。

2.3 方法評價

2.3.1線性關(guān)系、定量下限與檢出限按“1.2”色譜條件，對系列濃度的混合標準溶液進樣測定，以目標物的峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x，μg/L)繪制標準曲線，結(jié)果如表1所示。AFB1、AFB2、AFG1和AFG2在0.200～10.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2≥ 0.998 9。取系列混合標準溶液的最低濃度溶液逐級稀釋，進樣并記錄色譜圖，分別以信噪比S/N=10和S/N=3計，得到該方法的定量下限(LOQ)和檢出限(LOD)分別為0.100～0.200 μg/L和0.025～0.050 μg/L(見表1)。

表1 4種AF的線性范圍、線性方程、定量下限、檢出限及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear ranges，linear equations，LOQs，LODs and correlation coefficients of 4 AFs

2.3.2回收率與精密度以土榨花生油為例，按“1.5”方法進行樣品前處理，分別向不含AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的土榨花生油樣品中添加低、中、高(0.2、1、5 μg/L) 3個濃度水平的混合標準溶液適量，每組樣品平行實驗6次，連續(xù)測定6 d，結(jié)果如表2所示。4種AF的加標回收率為81.5%～96.9%，日內(nèi)相對標準偏差(RSD)為1.7%～3.4%，日間RSD為1.9%～3.5%，表明該方法的準確度和精密度良好。

表2 4種AFs的平均回收率和精密度Table 2 Mean recoveries and precisions of 4 AFs

圖3 AFs混合標準溶液(A)、空白土榨花生油樣品(B)和含AFB1的土榨花生油樣品(C)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of AFs mixsture standards(A)，blank groundnut oil sample extracted by native method(B) and groundnut oil sample containing AFB1 extracted by native method(C)1.AFG2；2.AFG1；3.AFB2；4.AFB1

2.4 方法應(yīng)用

采用該方法對市售5份花生油(其中2份為正規(guī)廠家生產(chǎn)，3份為榨油作坊生產(chǎn))、5份葵花籽油、5份大豆油和5份芝麻油樣品進行檢測，色譜圖見圖3。結(jié)果表明：1份土榨花生油樣品檢出AFB1，檢出量為2.2 μg/kg，未超標[29]，其它樣品未檢出上述4種AFs。推測原因可能是由于AF對花生具有較高的親和性，在潮濕環(huán)境下更易受到AF污染；由于榨油作坊原料儲藏不當，在加工過程中未對重度污染的原料進行挑選剔除，因此AF的檢出率較高，而正規(guī)廠家的食用油由于采用標準化生產(chǎn)，因此產(chǎn)品質(zhì)量能夠得到有效保障。

2.5 檢測方法的比較

考察了該方法與國標方法[28]的檢測結(jié)果差異，取不含AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的同一土榨花生油樣品，分別向其中添加低、中、高(0.2、1、5 μg/L)3個濃度水平的適量混合標準溶液，在相同條件下，分別采用本方法與國標方法平行測定6次，計算回收率(表3)。結(jié)果表明，該方法與國標方法的回收率無顯著性差異(P>0.05)。

3 結(jié) 論

本研究基于貽貝仿生化學(xué)技術(shù)，以多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物為固相萃取材料制備攪拌棒，建立了攪拌棒吸附萃取/高效液相色譜檢測食用油中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的方法。自制的攪拌棒能夠批量制備、重復(fù)利用，從而大大提高了實驗效率；通過對SBSE條件進行考察，優(yōu)化出最佳萃取條件，并將該方法應(yīng)用于食用油中4種AF的測定，實驗結(jié)果表明，該方法具有操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點，能夠滿足痕量AF的測定要求，為食用油中AF殘留的測定提供了方法參考。

表3 本方法與國標方法的實驗結(jié)果比對Table 3 Comparison results obtained from the presented method and the national standard method