基于單顆粒氣溶膠質譜的人體呼出顆粒物粒徑分布與化學成分的分析方法研究

金丹丹，Anthony S.Wexler，陳文年，劉 荔，周 振，李 雪*

(1.暨南大學 大氣環境安全與污染控制研究所，廣東 廣州 510632；2.暨南大學 廣東省大氣污染在線源解析系統工程技術研究中心，廣東 廣州 510632；3.美國加州大學戴維斯分校 空氣質量研究中心，美國加州 95616；4.香港中文大學 地球系統科學課程，香港 999077；5.丹麥奧爾堡大學 土木工程系，丹麥 奧爾堡 9210)

人體呼出氣中除含有已被廣泛研究的揮發性有機物外，還含有一定數目的氣溶膠顆粒物(0.001～4.644 個/mL)，其來源主要是呼吸過程產生的內源性顆粒物和人體吸入的外源性顆粒物[1-3]。人體呼出氣中的內源性氣溶膠顆粒物可能由呼吸道氣道壁的內襯液(Respiratory tract lining fluids，RTLFs)在氣道閉合、張開的過程中產生，其粒徑范圍主要為亞微米級[3]。內源性顆粒物的化學成分包括含氮的活性物質(硝酸鹽、亞硝酸鹽、3-硝基酪氨酸、亞硝基硫醇)、花生四烯酸、蛋白質、代謝物等[4]。人體呼出氣中的外源性顆粒物與人體所處的暴露環境有關，如鉛加工行業工人的呼出顆粒物中檢出了鉀、鉛、錳、銅、銻、鎘元素[5-8]。人體呼出氣顆粒物(Exhaled breath particles，EBPs)的粒徑和化學成分信息可用于疾病診斷[4，9]、環境暴露評價[5]等研究。

目前，檢測EBPs粒徑的方法主要采用差分電遷移率分析儀(Differential mobility analyzer，DMA)和掃描電遷移率粒徑譜儀(Scanning mobility particle sizer，SMPS)[10-11]。EBPs的化學成分則主要通過檢測呼出氣冷凝液(Exhaled breath condensate，EBC)的化學成分間接獲得。呼出氣EBC化學成分的分析方法包括電感耦合等離子體光譜、液相色譜、液相色譜-質譜、全反射X射線熒光分析等[4，10，12-13]。但EBPs的化學成分在冷凝過程中可能發生變化；冷凝時會富集呼氣中的水，導致樣品稀釋(EBC含水量約99.9%)，降低了待測物濃度，提高了對方法靈敏度的要求。

盡管單個顆粒物的質量僅為幾十fg,遠低于現有儀器的檢測限，但單個顆粒物中包含了數百萬個分子，因此，可以實現單個顆粒物的化學成分分析[14]。單顆粒氣溶膠質譜是一種基于質譜技術、可同時檢測單個顆粒物的粒徑和化學成分的實時質譜分析技術，一般由進樣系統、測徑系統、電離系統和質量分析系統4部分組成。目前基于SPMS技術的商品儀器有氣溶膠飛行時間質譜儀(Aerosol time of flight mass spectrometer，ATOFMS)(測徑范圍100～3 000 nm)[13，15- 16]和單顆粒氣溶膠質譜儀(Single particle aerosol mass spectrometer，SPAMS)(測徑范圍200～2 000 nm)[17-20]，主要用于大氣PM2.5來源解析、大氣化學過程(如二次有機氣溶膠形成過程和機制、大氣氣溶膠混合狀態)等研究，而在人體EBPs粒徑和化學成分研究中的應用尚未見報道。

綜上所述，本文初步考察了SPAMS檢測人體EBPs粒徑分布和化學成分的可行性，嘗試解析呼出顆粒物的粒徑分布和化學成分中的信息。

1 實驗部分

1.1 人體呼氣樣品采集

采樣點在暨南大學大氣環境安全超級站(簡稱“大氣超級站”)樓頂的露天平臺。大氣超級站位于廣州市天河區暨南大學圖書館頂層，北緯23.13°，東經113.35°，距地面約40 m。東距華南快速路約350 m，南距黃埔大道(城市主干道)約400 m，西向500 m左右是高約60～80 m的居民住宅樓群，北向750 m為中山大道(城市主干道)。點位周邊無工業污染源。

如圖1所示，1位29歲的健康女性站立在露天平臺上，采用鼻吸、嘴呼的方式，呼吸數次后，將呼出氣收集在3-L Tedlar氣袋內。吸入氣未經顆粒物過濾處理，所以含有大氣顆粒物。采樣過程中，用鋁箔包裹氣袋并加熱，加熱溫度為40 ℃(圖1)，以避免呼出氣中的水汽凝結在氣袋內壁。共采集6袋呼出氣樣品，集滿1袋氣約需40 s。在使用前，Tedlar氣袋用氮氣(純度≥99.999%)反復清洗。Tedlar氣袋上裝有雙閥，在清洗氣袋過程中，一個閥接氮氣，氮氣以一定流速充入氣袋，另一個閥排出清洗氣，氣袋內的氣體體積保持在2 L左右，一般清洗5 min。將清洗后的氣袋內充滿N2，用SPAMS分析，若10 min內檢測到的累計顆粒個數<3個，則認為氣袋清洗干凈，否則重復上述清洗過程。

圖1 基于SPAMS的人體EBPs分析裝置Fig.1 Schematic of detection of EBPs by using SPAMS

1.2 樣品分析

樣品采集后立即進行分析。采用Nafion管(MD-700-06F-1，美國博純有限責任公司)連接氣袋出氣口和SPAMS進樣口，進樣流速100 mL/min(圖1)。Nafion管的作用是降低呼氣濕度，減小樣品中水汽對SPAMS電離效率的影響。Nafion管的反吹氣是由氣瓶提供的干燥空氣，流速200 mL/min。樣品分析過程中，保持氣袋處于40 ℃恒溫狀態。樣品進入儀器前的相對濕度和溫度分別為38%～60%和27 ℃。環境空氣樣品直接進樣分析。一般先測環境空氣樣品，然后采集人體呼出氣樣品進行SPAMS分析。呼氣樣品用氣袋采集而未直接分析是由于SPAMS的進樣流速為100 mL/min，低于人體呼出氣流速(健康成人1 min內呼出氣體體積為1 000～1 500 mL)，若直接采集，樣品利用效率低，志愿者需在儀器前連續呼氣15～20 min才能獲得足夠的顆粒數進行數據分析。

SPAMS(型號0515，廣州禾信儀器股份有限公司)檢測EBPs的過程為[21-22]：EBPs通過進樣小孔(0.1 mm)從大氣壓環境進入儀器內的真空環境，在空氣動力學透鏡的作用下聚焦成顆粒束，經過兩束相距一定距離的測徑激光(532 nm)，EBPs在這兩束激光之間的渡越時間，一方面用于計算顆粒的空氣動力學直徑，另一方面用于觸發下一階段的電離激光(266 nm)；EBPs在電離區中心時，被電離激光電離為帶正電荷和負電荷的碎片離子，這些碎片離子由雙極飛行時間質量分析器分別檢測(圖1)。SPAMS的最大檢測速度為20 個/s，測徑范圍為200～2 000 nm，電離效率(電離顆粒數/測徑顆粒數)為20%～30%，質量數掃描范圍為m/z1～250，質量分辨率為500 FWHM(Full width at half maximum，半峰寬)。

采用與儀器配套的數據分析軟件SPAMS_ANALYZE_V1.8.4.1對數據進行分析。根據測徑激光測定的飛行時間，通過軟件計算獲得顆粒的空氣動力學直徑[21-22]；根據質譜檢測到的碎片離子的質荷比，通過軟件計算得到各離子的元素組成，并與文獻報道的碎片離子進行比對，確認碎片離子的元素組成[10，23-24]。

1.3 SPAMS校準

SPAMS的校準分為粒徑校準和質量數校準兩部分，分別用以保證檢測顆粒物粒徑和質量數的準確性，具體操作流程參照儀器使用手冊。

粒徑校準：通過氣溶膠發生器產生標準粒徑(200、300、500、720、1 000、1 300、2 000 nm)的聚苯乙烯小球(PSLs)校正粒徑檢測系統，校準系數R2>0.99。

質量數校準：使用10 mg/mL的NaI標準物質氣溶膠校準飛行時間質量分析器。

2 結果與討論

2.1 EBPs粒徑分布初步研究

6袋樣品測得的測徑顆粒數、電離顆粒數、電離效率、實測體積和顆粒濃度如表1所示。平均電離效率為19.3%，屬儀器正常水平。實測體積為2.03～2.39 L，小于采樣體積(約3 L)，目的在于避免當氣袋中氣體含量較少，從氣袋抽氣時混入室內空氣顆粒物，造成干擾。6袋呼出氣樣品中EBPs數濃度為227～1 043個/L。Almstand 等[10]用顆粒計數裝置檢測到的人體呼出內源性顆粒數濃度為200～2 000個/L(0.3～0.5 μm)?？紤]到本研究檢測到的EBPs數濃度包含內源和外源兩類顆粒物，因此需進一步分析EBPs中內源性和外源性顆粒物的分布情況，以評估方法的檢測效率。

表1 EBPs的測徑顆粒數、電離顆粒數、電離效率、實測體積和顆粒濃度 Table 1 Number of particles with diameter measured，number of particles ionized，ionization efficiency and particle concentration of exhaled particles

*NoSizing：number of particles with measured size；NoIonization：number of ionized particles.For these particles，mass spectra were obtained under both positive and negative ion detection modes；ionization efficiency：ratio between NoIonizationand NoSizing；sampling volume is calculated by timing sample flow rate(100 mL/min) with sampling time；CN-EBPs：number concentration of EBPs；CE-EBPs：number concentration of particles in ambient air

逐袋累加顆粒數(表1)，分析粒徑分布隨總顆粒數的變化，判斷獲得穩定粒徑分布的最少顆粒數，即檢出限(Limit of detection，LOD)。在總顆粒數分別為1 212、2 248(通過累加S-1和S-2中測得的顆粒數獲得)、2 725(累加S-1、S-2和S-3測得的顆粒數)、4 165(累加S-1、S-2、S-3和S-4測得的顆粒數)、5 798(累加S-1、S-2、S-3、S-4和S-5測得的顆粒數)和8 105(累加S-1、S-2、S-3、S-4、S-5和S-6測得的顆粒數)的情況下，粒徑分布特征幾乎一致(如圖2A)，即EBPs主要分布在200～1 000 nm、峰值出現在460 nm；各粒徑段相對顆粒數(Relative particle number，RPN)相關性分析的判定系數R2表明，當總顆粒數為2 725～8 105時，4個R2值為0.993 7～0.998 3,且無顯著差異(如圖2B)，表明當總顆粒數為2 725時，EBPs的粒徑分布特征趨于穩定，因此確定獲得具統計意義的粒徑分布所需的LOD為2 500個顆粒物，應采集至少10 L呼氣樣品。RPN是通過比較SPAMS各粒徑分析通道測得的顆粒數與整個粒徑范圍(200～2 000 nm)獲得的總顆粒數計算獲得。

當呼出氣和環境空氣樣品中總顆粒數分別為8 105(數濃度227～1 043 個/L)和7 516(數濃度1 583～3 847 個/L)(表1)時，EBPs和環境空氣顆粒物RPN相關性分析的R2為0.980 5(圖3A)，小于EBPs穩定粒徑分布間相關性分析的R2(圖2，0.993 7～0.998 3)，表明EBPs和環境空氣中顆粒物的粒徑分布存在差異。通過觀察呼出氣和環境空氣樣品中顆粒物的粒徑分布，發現在200～300 nm和440～660 nm范圍內EBPs的RPN略高于環境空氣顆粒物；而在320～420 nm和680～2 000 nm范圍內，EBPs的RPN略低于或等于環境空氣顆粒物。環境空氣顆粒物主要分布在200～1 000 nm(圖3B)，而內源性顆粒物的粒徑范圍主要涵蓋50～ 3 000 nm[3]。因此本實驗在200～2 000 nm范圍內測得的EBPs粒徑分布，應該是內源性和外源性顆粒物粒徑分布的混合結果，而呼出氣與環境空氣粒徑分布的差異，既有內源性顆粒物的貢獻，也有外源性顆粒物在吸入人體后經過體內沉積、吸濕增長等過程，影響了顆粒物再次被呼出時粒徑分布的原因。

2.2 EBPs化學成分初步研究

圖4 正(Pos.)、負離子(Neg.)檢測模式下呼出與吸入空氣顆粒物的平均質譜圖Fig.4 Average mass spectra of particles under positive(Pos.) and negative(Neg.) ion detection modes

3 結 論