甘藍型油菜種子特異表達油體蛋白啟動子PBnOA03的克隆及功能分析

王海蘭，賈慶利，趙翠珠，楊 錚，王 凱，劉香伶，唐 通，宋 歡，張 猛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是基因功能分析和外源基因在植物中穩(wěn)定表達的一種不可或缺的強大工具。在植物遺傳工程中，引入的靶基因通常需要在特定的時期或組織器官中表達，這些問題通常通過特異表達的啟動子來解決。啟動子在起始和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中有著重要的作用，也是分子育種中的重要研究部分。目前已有很多啟動子被鑒定，并在農(nóng)業(yè)基因工程中用來控制基因的表達。例如CaMV 35S啟動子[1]、RuBisCo大型亞基啟動子[2]和NOS啟動子[3]。在大多數(shù)情況下，目標基因是被一個組成型啟動子所驅(qū)動而表達。例如CaMV 35S，這一啟動子在植物的大部分組織中都具有較強的表達水平。然而，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的連續(xù)合成和大量的積累，會對轉(zhuǎn)基因植物的代謝過程造成干擾，從而產(chǎn)生一些不良的多效性反應(yīng)[4]，有時還會對組織產(chǎn)生毒性[5]。因此，有效利用特異表達的啟動子，將會極大地滿足轉(zhuǎn)基因作物的需求[6]。這類啟動子被稱為組織特異性啟動子[7]，包括葉片、莖、根、果實、花粉和種子等特異性啟動子。

油菜(BrassicanapusL.)是重要的油料作物之一，是植物油和植物蛋白的重要來源，在中國乃至全世界都有廣泛的種植[8]。油菜種子的產(chǎn)量及其品質(zhì)直接關(guān)系到油菜的經(jīng)濟價值，除了作為食用油，油菜籽還可作為生物能源，這也是用來解決未來能源危機的途徑之一。因此，可以通過構(gòu)建一個種子特異性的啟動子來讓基因在油菜種子中特異性表達，從而達到改良油菜種子特性、提高油菜的產(chǎn)量和改良油菜脂肪酸組分的目的[9]。目前，油菜中報道的特異性啟動子的研究相對來說較少，并且大部分還受到專利的保護。因此，油菜組織特異性啟動子的研究，對于油菜及其他作物的基因工程改良方面都會具有極其重要的作用。甘藍型油菜在種子特異性啟動子的研究方面主要注重于油菜籽的特性改良，近些年來應(yīng)用最多最廣泛的屬于napin啟動子。napin是十字花科植物中重要的儲藏蛋白，由多基因編碼，在種子發(fā)育后期開始表達。最早在1987年，Josefsson等[10]克隆到編碼儲藏蛋白napA的基因；隨后Ericson等[11]克隆到napB上游序列，發(fā)現(xiàn)了和擬南芥同源性較高的一些保守區(qū)域；Zhang等[12]從油菜基因組中分離出來300 bp的napinB基因，經(jīng)序列分析表明，該序列含有與種子特異相關(guān)的高度保守的順式元件，在煙草中轉(zhuǎn)化并通過GUS報告基因分析表明，它在胚和胚乳中特異性表達。另外，亞細胞定位及表達分析發(fā)現(xiàn)， FAE1能在胚珠中特異性表達[13]。隨后有研究者對 FAE1的上游區(qū)域進行研究，發(fā)現(xiàn)上游序列中含有較多與種子特異表達相關(guān)的順式作用元件，例如RY-repeat[14]、G-box和E-box[15-16]。

油體蛋白(Oleosin)是一類存在于油體表面的小分子蛋白[17]，存在種子特異表達和非特異表達兩種類型。本研究中，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在對甘藍型油菜種子中油體蛋白基因的表達模式進行分析的基礎(chǔ)上，選擇種子特異表達的油體蛋白，開展啟動子PBnOA03的克隆、序列分析以及轉(zhuǎn)基因株系的功能驗證。這種種子特異表達的啟動子，可以作為農(nóng)作物基因工程種子改良新的工具。該啟動子順式元件的分析，也為以后油體蛋白的調(diào)控研究提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為陜西省油菜雜交中心提供的甘藍型油菜‘秦油7號’；野生型擬南芥為Columbia生態(tài)型Col-0；試驗所用大腸桿菌為DH5α；農(nóng)桿菌菌株為GV3101，表達載體為pBI121。

質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購置于Omega公司；T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶購置于Takara公司；DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細胞、高保真DNA聚合酶購置于全式金公司；DNA Marker購置于西安擎科生物公司；試驗中所涉及的引物均使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計合成，由西安擎科生物公司合成。

1.2 甘藍型油菜油體蛋白基因在組織中的表達量分析

通過表達量分析網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn& BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=SRA&SHOW_DEFAULTS=on)對備選基因在油菜種子不同發(fā)育時期和在根、子葉、葉片等不同組織的表達量進行分析。首先，在NCBI的SRA中搜索相關(guān)的信息，找到油菜表達的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得其SRX號以及表達數(shù)據(jù)(N)；其次，在SRA的BLAST頁面中，將備選的基因序列與SRX進行比對，表達量選擇參數(shù)為：Max target sequences=20 000、Expect threshold=0.000 000 000 1、indenity>100%，從而選擇出該基因的表達數(shù)據(jù)(N1)；最后，計算FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值，F(xiàn)PKM=N1×105/N。

1.3 啟動子克隆

1.3.1 DNA提取 將油菜種子點播于營養(yǎng)土[V(基質(zhì))∶V(珍珠巖)∶V(蛭石)=3∶1∶1]中，待其生長20 d左右，用CTAB法[18]提取葉片的DNA。

1.3.2 引物設(shè)計及基因克隆 參考擬南芥油體蛋白在種子及其他組織的表達模式，在油菜數(shù)據(jù)庫尋找甘藍型油菜的同源基因。根據(jù)這些同源基因的序列，利用甘藍型油菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫資料，分析相應(yīng)基因在不同組織中的表達水平。選擇種子特異表達且表達量最高的一個基因或重復(fù)基因，找到該基因的上游序列位置，在其末端與該基因起始密碼子的區(qū)段內(nèi)設(shè)計引物BnOA03-F/R(所涉及引物信息詳見表1)。以所提取的油菜DNA為模板進行擴增，反應(yīng)體系為：在50 μL的體系中加入1.5 μL油菜DNA，4 μL dNTP，10 μL 5×PS Buffer，0.5 μL Primer star，31.5 μL超純水以及1.5 μL BnOA03-F/R引物。經(jīng)過95 ℃預(yù)變性4 min后，95 ℃變性30 s ，57 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)紫外顯影顯示PCR產(chǎn)物與目標片段大小一致。用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，再經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ雙酶切回收產(chǎn)物和PMD19-T后，進行T4連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化，最后進行菌體PCR，選擇符合要求的菌液提取質(zhì)粒進行測序。

1.4 啟動子序列分析

將克隆的啟動子PBnOA03的序列在啟動子在線分析軟件PLACE(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?lang=en&pj=640& action=page&page=newplace)上進行分析，并對分析得到的順式作用元件進行分類總結(jié)。

1.5 表達載體構(gòu)建

對經(jīng)過測序的質(zhì)粒和表達載體pBI121進行HindⅢ和XbaⅠ雙酶切處理，37℃酶切4 h，分別回收質(zhì)粒和表達載體pBI121的酶切產(chǎn)物。利用T4DNA連接酶連接，反應(yīng)體系為：1 μL 回收啟動子質(zhì)粒片段，6 μL回收pBI121片段，2 μL 5×T4Buffer，1 μL T4連接酶，在PCR中25 ℃反應(yīng)10 min。然后用熱激法進行大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。從過夜培養(yǎng)的平板中挑取單克隆于1 mL含有50 mg/L的卡那霉素液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以單克隆的菌液為模板，用BnOA03-Fy/Ry引物進行PCR擴增鑒定。然后將正確菌液擴繁提取質(zhì)粒，經(jīng)凍融法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，經(jīng)驗證引物BnOA03-Fy/Ry檢測后，用于遺傳轉(zhuǎn)化。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.6 擬南芥轉(zhuǎn)化及陽性苗鑒定

采用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥(方法參考Clough等[19])。轉(zhuǎn)化大約25 d后收取種子，將收獲的T1代種子消毒后撒播至含有50 mg/L的卡那霉素的1/2 MS平板上，一周后篩選陽性苗，移栽至營養(yǎng)土中，置于22 ℃，16/8 h光周期的培養(yǎng)室進行生長。

待植株正常生長至抽薹時，用CTAB法提取葉片DNA，用BnOA03-Fy/Ry引物進行PCR擴增，以確定轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.7 轉(zhuǎn)基因陽性植株GUS染色

將T1代植株收獲的種子在含有卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上撒播，觀察生長，選擇有3∶1分離比的單位點插入轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)研究。將挑選的轉(zhuǎn)基因陽性植株轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土，分別取其萌發(fā)5 d的幼苗，開花時期的莖、莖生葉、蓮座葉和花，以及生長至成熟階段的種子，分別為開花后4、7、11、15、18、21 d的角果，對這些組織進行GUS染色。另外選擇實驗室?guī)в蠫US報告基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥材料作為陽性對照。染色液成分為：50 mmol/L NaPO4(pH=7.2)，0.5 mmol/L K3Fe(CN)6，0.5 mmol/L K4Fe(CN)6，2 mmol/L X-Gluc。GUS染色方法參見 Jefferson等[20]方法，用體式顯微鏡觀察擬南芥不同組織的GUS染色情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍型油菜油體蛋白的表達模式分析

在擬南芥的15個油體蛋白中有11個油體蛋白基因的表達模式可以搜索到。對這11個油體蛋白進行分類分析，發(fā)現(xiàn)有3種類型，種子特異、非種子特異以及組成型表達。參考擬南芥油體蛋白的表達模式，選擇不同類型的油體蛋白進行分析。為了簡潔，本文僅列出幾個有代表性的油體蛋白的結(jié)果。擬南芥OLE(AT2G25890)在種子中表達較高且在其他組織中也有表達，它在甘藍型油菜中存在2個同源基因，分別命名為 BnOA04和 BnOC04；擬南芥OLE(AT5G56100)在根、莖、葉和種子中都有較高表達，它在甘藍型油菜中存在2個同源基因，分別命名為 BnOA02、BnOC02；擬南芥OLE(AT3G01570)是一個種子特異表達的油體蛋白，它在甘藍型油菜中存在2個同源基因，分別命名為 BnOA03、 BnOC03。根據(jù)它們的編碼區(qū)序列，分析這些同源基因在油菜組織中的表達量，結(jié)果見圖1。圖1-A中的數(shù)據(jù)來源于對甘藍型油菜種子不同發(fā)育時期研究的4個數(shù)據(jù)庫。從圖1-A可以看出，基因 BnOA03的表達量在授粉后2周開始成倍增加，在第6周達到最高，6周之后雖然表達量下降，但是其表達水平較其他基因依然較高；其同源基因 BnOC03的表達趨勢與其一致，但是表達量稍低于 BnOA03。其余基因在種子整個發(fā)育時期表達量都較低。圖1-B中子葉和葉片的數(shù)據(jù)來源于3個數(shù)據(jù)庫，根的數(shù)據(jù)來源于一個數(shù)據(jù)庫。從圖1-B中可以看出，油菜油體蛋白基因在根、子葉和葉片中的表達量都較低，甚至不表達。根據(jù)表達量分析結(jié)果，最終本研究選擇 BnOA03油體蛋白基因為目標基因。

2.2 啟動子克隆及序列分析

以所提取的油菜DNA為模板，利用引物BnOA03-F/R進行擴增。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2-A，PCR產(chǎn)物為715 bp，其結(jié)果與油菜數(shù)據(jù)庫獲得的片段大小一致。該啟動子命名為PBnOA03。

A.油體蛋白基因在油菜種子授粉后不同時間的表達量 The expression of oleosin gene at different time after pollination of Brassica napus;B.油體蛋白基因在油菜不同組織中的表達量 The expression of oleosin gene at different tissues of Brassica napus

對啟動子序列進行在線分析，結(jié)果見圖3和表2。PBnOA03啟動子中含有水稻胚乳特異性表達順式調(diào)控元件Skn-1基序[21]、ABRE應(yīng)答元件[22]、對轉(zhuǎn)錄起始有重要作用的TATA-BOX[23]、與儲藏蛋白基因有關(guān)的E-BOX[15]和與激素調(diào)節(jié)有關(guān)的W-BOX[22]等順式元件。CAAT-BOX對基因的轉(zhuǎn)錄起到很強的激活作用[24]，也可以通過與其他順勢作用元件的協(xié)同來達到調(diào)控基因高效表達的作用。除此之外，PBnOA03啟動子中還存在與種子特異性相關(guān)的順式元件RY-motif[14]、與光效應(yīng)有關(guān)的G-BOX和T-BOX順式元件[16]。啟動子中存在的這些順式元件，將為今后研究該啟動子的調(diào)控提供重要的信息。

A:PCR擴增啟動子PBnOA03片段 Fragment of PBnOA03 promoter amplified by PCR；M.DNA marker 5000; 1.PCR擴增啟動子PBnOA03片段 Fragment of PBnOA03 promoter amplified by PCR) B:PCR擴增篩選陽性克隆電泳圖 PCR screen of positive clones;M.DNA marker 2000; 1-2.挑選的陽性克隆菌落PCR產(chǎn)物 PCR products of positive clones; P.質(zhì)粒對照 Plasmid

2.3 植物表達載體構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化

對連接啟動子序列的中間載體PMD19-T和pBI121進行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物，利用T4DNA連接酶連接，然后用熱激法進行大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化，并進行單克隆菌落PCR鑒定。經(jīng)電泳檢測顯示PBnOA03啟動子成功連入pBI121(圖2-B)。經(jīng)測序確認后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，重組載體圖如圖4-A。驗證后進行擬南芥轉(zhuǎn)化。經(jīng)過抗性培養(yǎng)基篩選得到37株T1代轉(zhuǎn)基因植株，提取篩選到的這些植株葉片DNA，利用BnOA03-Fy/Ry引物進行PCR檢測。以質(zhì)粒為陽性對照，野生型擬南芥DNA為陰性對照。檢測結(jié)果見圖4-B。

根據(jù)上圖PCR的結(jié)果顯示，篩選轉(zhuǎn)基因陽性苗。

2.4 啟動子功能分析

對8個T1代株系的葉片、莖、花器和發(fā)育種子進行初步GUS染色。結(jié)果表明，在營養(yǎng)器官和花器中均無GUS染色，而在種子發(fā)育中后期有GUS染色，表明該啟動子具有活性。進一步對試驗中得到的T2轉(zhuǎn)基因株系進行系統(tǒng)的GUS染色。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基上生長了5 d的幼苗(圖5-B)中的各個部位都沒有發(fā)現(xiàn)GUS基因的明顯表達(以5 d幼苗為陽性對照如圖5-A)；在莖(圖5-C)、莖生葉(圖5-D)、蓮座葉(圖5-E)、花(圖5-F)中沒有發(fā)現(xiàn)GUS染色，其中花器的雌蕊柱頭部分、花瓣和雄蕊的花藥、花絲也沒有發(fā)現(xiàn)GUS染色信號。

紅色代表Skn-1基序 Red represents Skn-1motif; 棕色代表ABRE Brown represents ABRE; 藍色代表G-BOX Blue represents G-BOX; 綠色代表GTGA-motif Green represents GTGA-motif; 橙色代表T-box Orange represents T-box ; 紫色代表CAAT-BOX Purple represents CAAT-BOX; 粉色代表RY-motif Pink represents RY-motif; 黃色代表W-BOX Yellow represents W-BOX; 灰色代表TATA-BOX Gray represents TATA-BOX

表2 PBnOA03啟動子的表達元件分析Table 2 Analysis of regulatory elements in PBnOA03 promoter

A:PBnOA03∶∶GUS 載體結(jié)構(gòu) Construction of PBnOA03∶∶GUS B:PBnOA03啟動子T1轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測 Identification of PBnOA03 promoter T1 transgenic plants by PCR；1.轉(zhuǎn)化苗 Transgenic plants; W.野生型對照 Wild type;P.質(zhì)粒對照 Plasmid; M.DNA marker 2000

A.5 d幼苗(對照) 5 days old plant(CK); B.5 d幼苗 5 days old plant; C.莖 Stem; D.莖生葉 Leaf of stem; E.花 Flower; F.蓮座葉 Rosette leaf; G.開花后4 d角果 4 days after flower of silique; H.開花后7 d種子 7 days after flower of seed; I.開花后11 d種子 11 days after flower of seed; J.開花后15 d種子 15 days after flower of seed; K.開花后18 d種子 18 days after flower of seed; L.開花后21 d種子 21 days after flower of seed

不同時期角果的GUS染色結(jié)果中表明，野生型在各個時期都未檢測到背景GUS染色；在轉(zhuǎn)化啟動子的材料中，開花后4 d的種莢和株柄(圖5-G)沒有GUS染色，在開花后7 d的種莢中剝離的種子(圖5-H)也沒有發(fā)現(xiàn)有GUS染色；在開花后11 d的角果中，種莢和株柄沒有染色，而在剝離的種子(圖5-I)中發(fā)現(xiàn)有GUS的淺著色；開花后15 d的角果中，種莢和株柄都沒有染色，在種子中(圖5-J)可以檢測到有明顯GUS染色；開花后18 d的角果中，種莢和株柄均沒有染色，而在種子中(圖5-K)發(fā)現(xiàn)較深的GUS染色；開花后21 d的角果中，種莢、株柄和種子中(圖5-L)都沒有檢測到GUS染色信號。這些染色結(jié)果與T1代陽性植株的染色結(jié)果一致。這些結(jié)果表明PBnOA03啟動子是一個在種子發(fā)育中后期進行啟動基因表達的種子特異性啟動子。

3 討 論

本試驗中共得到8個轉(zhuǎn)基因系，對得到的轉(zhuǎn)基因系的T1代植株幼葉和不同發(fā)育時期的種子進行GUS染色，在葉片等組織中沒有發(fā)現(xiàn)GUS染色，而在種子發(fā)育的中后期檢測到GUS染色。在得到的8個轉(zhuǎn)基因系中有7個系在種子開花后的11、15、18 d中能檢測到逐漸增強的GUS基因活性，其中，2個系在開花后21 d還可以檢測到有部分的GUS染色信號。在T2代時各組織和種子的GUS活性檢測與T1代一致。這與之前分析的基因在油菜授粉后不同周期的種子中的表達趨勢一致。

但在本研究中，GUS基因活性在種子開花后11 d時開始有信號，但信號不強，到18 d有信號增強的過程。然而，擬南芥種子在發(fā)育的過程中，開花后11～15 d時，是其合成油脂和儲藏物質(zhì)的主要階段。也就是說，該啟動子在擬南芥上表達的高峰相對油菜來講，出現(xiàn)延遲表達的情況。本研究中，分析出現(xiàn)這種的情況的原因可能有：(1)擬南芥和油菜雖均屬十字花科、有一定的親緣關(guān)系，但是隨著植物發(fā)生進化，擬南芥屬于阿拉伯屬，而油菜屬于蕓薹屬。此外，油菜在進化時基因組遠較擬南芥復(fù)雜[25]。(2)油菜種子在授粉后50 d 左右獲得成熟種子，而擬南芥在開花后23 d左右就可以獲得成熟種子，擬南芥的發(fā)育周期為油菜的一半，而本試驗參照油菜的發(fā)育周期構(gòu)建的啟動子，在容易轉(zhuǎn)化的擬南芥上進行驗證，這可能是表達時期出現(xiàn)延后的原因之一[25]。(3)本試驗所構(gòu)建的啟動子約700 bp。在克隆啟動子時，完整的克隆了基因上游直到另一個基因的全部序列。但考慮到基因的表達調(diào)控是一個非常復(fù)雜的過程，不能排除啟動子序列之外還存在其他的輔助調(diào)控序列，這些序列有可能對該基因的表達有修飾作用。在進行該啟動子的后續(xù)研究中，可嘗試在其他植物上進行驗證分析，例如，克隆油菜基因的啟動子選擇煙草[14]來驗證,它的種子成熟的周期與油菜大體相近，為授粉后的40 d 左右，或者用油菜[26]本身來驗證，這些后續(xù)研究將有助于分析出現(xiàn)這一情況的原因。