黃芪多糖對新城疫活疫苗免疫增強的作用

汪宏才，商 雨，溫國元，任項霏，羅 玲，張蓉蓉，曾 哲，徐英英，羅青平

（1.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，武漢 430064；2.農業農村部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室，武漢 430064；3.畜禽病原微生物學湖北重點實驗室，武漢 430064）

黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是黃芪根部主要活性成分，具有免疫調節、抗氧化、抗炎等生物活性［1，2］。APS 屬于藥用植物多糖，無毒、無副作用［3］，在中醫領域有著廣泛的應用。天然多糖具有良好的免疫促進作用，同時能提高體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫［4］。APS 是乙型肝炎DNA 疫苗的有效佐劑，可以通過促進樹突狀細胞（DC）成熟和抑制調節性T 細胞（Treg）頻率來增強乙型肝炎DNA 疫苗的免疫反應［5］。在獸醫方面APS 的應用也逐漸增多，Abdullahi 等［6］證實口服APS 可以改善免疫反應方面的潛力，可用作H5N1 疫苗的佐劑。SHAN 等［7］認為口服APS 可以增強雞的腸黏膜免疫功能，可作為疫苗增強劑。薛力剛［8］通過將黃芪多糖聯合新城疫疫苗進行胚胎免疫，證明了APS 可以促進了雛雞早期生長發育，并且可以增強了ND 疫苗的免疫效果。國內外學者將APS 應用于提高ND 疫苗的免疫方面［9，10］，并且取得了良好的效果。APS 在新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）La Sota 方面的應用較多，大多采用口服、飲水或注射的方式，在免疫前或免疫后分開使用APS，而APS 在NDV V4 株和HB92 株［11］方面的應用鮮見報道。由于V4 株是一種耐熱嗜腸道病毒，具有良好的黏膜免疫和細胞免疫特性。本研究將APS 作為ND V4 和HB92 株活疫苗的免疫增強劑，通過滴鼻點眼的方式進行免疫接種，檢驗抗體滴度和疫苗保護率，評價疫苗的保護效果，為APS 在新城疫活疫苗在不同免疫途徑方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

NDV V4 株、NDV HB92 株由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所禽病團隊實驗室保存。雞NDV 北京株（CVCC AV1611），購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心。黃芪多糖粉購自北京索萊寶科技有限公司（批號616G021）。NDV HI 抗原，購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。SPF 雞胚購于北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。1%雞紅細胞，實驗室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 病毒傳代 將NDV V4 株、HB92 株分別在SPF 雞胚上傳代1～3 代，選擇HA 血凝效價達到8log2 的尿囊液，-80 ℃保存備用。

1.2.2 毒價測定 將含毒尿囊液使用PBS 進行10倍梯度稀釋至10-9，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95 個稀釋度，每個稀釋度通過尿囊腔接種5 枚9～10 日齡SPF 雞胚，每胚接種0.1 mL，觀察120 h，逐胚測定尿囊液HA 效價，以HA≥7log2 判定為感染，按照Reed-Muench 法計算病毒EID50。

1.2.3 抗原配制 按照參考文獻［9］的方法配制APS 溶液。將APS 用PBS 溶解后，使最終APS 含量為0.5%。根據試驗分組，用APS 溶液稀釋NDV 至104.0EID50/0.1 mL，4 ℃冷藏備用。

1.2.4 試驗分組 將50 羽試驗雞平均分為5 組，每組10 羽。4 個免疫組接種劑量同為104.0EID50，第1組用PBS 稀釋V4 株，第2 組用APS 溶液稀釋V4 株；第3 組用PBS 稀釋HB92 株，第4 組用APS 溶液稀釋HB92株；第5組為空白對照組。具體分組信息見表1。

表1 試驗分組

1.2.5 動物試驗 雛雞飼養至30 日齡，并于7、30 d隨機選取5 羽雛雞，采集血液分離血清，檢測母源抗體。按照分組，V4 株和HB92 株采用滴鼻點眼的方式，接種30 日齡雛雞，并于免疫后7、14 d 分別采血檢測血凝抗體，14 d 后連同對照組肌肉注射104.0ELD50（0.1 mL）北京強毒株，觀察14 d，統計發病死亡數量，計算保護率。對照組應全部死亡，免疫組保護率達到90%為合格。

2 結果與分析

2.1 病毒毒價測定結果

將凍干的NDV V4 株和HB92 株，通過SPF 雞胚復蘇后，測定EID50。結果發現，V4 株和HB92 株病毒毒價分別為108.7EID50/0.1 mL 和107.9EID50/0.1 mL（表2）。

2.2 抗體檢測

使用微量法血凝抑制試驗（HI），檢測免疫前母源抗體、7 日齡和14 日齡抗體。結果顯示，免疫前母源抗體全部降至2log2 以下，符合試驗要求。7 日齡時，V4+APS 組顯著高于V4 組，但均低于4Log2；HB92+APS 組低于HB92 組（圖1）。免疫14 d，HB92組和HB92+APS 組抗體均超過4Log2，且添加APS 的免疫組抗體顯著高于未添加APS 組（P＜0.05）（圖2）。

2.3 攻毒保護

免疫14 d，連同對照組肌肉注射104.0ELD50北京強毒株，對照組雞全部死亡，保護率為0，V4 免疫組保護率為70%，其余3 個免疫組保護率為100%（表3）。試驗雞的死亡高峰集中在攻毒后3～5 d（圖3），添加APS 的試驗雞能有效抵抗強毒的攻擊。

表3 NDV 攻毒保護

3 小結

APS 作為免疫保護劑，在獸醫上已有廣泛的應用。在家禽方面，主要用于提高疫苗的免疫效果，在免疫的同時注射APS，提高體液免疫。低劑量黃芪多糖可顯著提升ND 抗體滴度，有顯著的免疫增強功能［12，13］。采用皮下注射APS 方式，抗體產生早、抗體持續時間長、效價高，對疫苗免疫有很強的輔助效果［14，15］。在細胞免疫和黏膜免疫方面，APS 還可以促進細胞免疫功能［16-18］。

不同疫苗毒株、不同的免疫途徑，免疫效果存在顯著差異。本試驗采取滴鼻點眼的傳統方式進行免疫，符合國內大多數養殖場采用的免疫方法。滴鼻點眼免疫途徑可有效刺激黏膜免疫［15，17，19］和體液免疫［20］。APS 不僅可以作為免疫增強劑，還可以作為疫苗凍干保護劑，減少凍干過程中的抗原損失。APS 還是一種具有免疫調節作用的中草藥綠色飼料添加劑，有顯著提高動物免疫功能的作用［21］。

《中華人民共和國獸藥典》規定，ND 活疫苗的免疫劑量不低于106.0EID50/羽份，本試驗采取104.0EID50作為免疫劑量，旨在最小免疫劑量檢驗V4 和HB92這2 個疫苗株的免疫效果?？贵w水平的高低，是評價疫苗免疫效果的一種簡單、常用的方法，在臨床上經常使用，但這僅反映了體液免疫情況，而沒有客觀反映黏膜免疫和細胞免疫效果。

本試驗通過強毒攻擊試驗，結合免疫后抗體檢測，從客觀上反映了ND 活疫苗的綜合免疫效果，證明APS 對于ND V4 株活疫苗、HB92 株活疫苗具有顯著的免疫增強作用，能夠有效抵抗ND 強毒的感染，保護率達到100%，為V4 株和HB92 株ND 活疫苗的臨床應用提供了一種新的途徑。