核磁共振技術解析阿伐他汀鈣的分子結構

梁向暉, 鐘偉強, 毛秋平

(華南理工大學 化學與化工學院, 廣東省功能分子工程重點實驗室, 廣東 廣州 510640)

1 阿伐他汀鈣簡介

阿伐他汀鈣(atorvastatin calcium)為1996年經美國FDA批準上市的HMG-CoA還原酶抑制劑, 是新一代的高效降血脂藥[1-2]。該藥不僅能降低膽固醇, 而且能降低甘油三酯, 其作用遠遠優于其他他汀類藥物, 具有廣闊的市場前景。阿伐他汀鈣本身無活性,口服吸收后的水解產物在體內競爭性地抑制膽固醇合成過程中的限速酶羥甲戊二酰輔酶A還原酶,使膽固醇的合成減少,也使低密度脂蛋白受體合成增加,主要作用部位在肝臟,結果使血膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平降低,中度降低血清甘油三酯水平和增高血高密度脂蛋白水平[3-4]。由此對動脈粥樣硬化和冠心病的防治產生作用。

有關阿伐他汀鈣的應用研究已有報道[5-8],但是利用液體核磁技術對其核磁共振(NMR)信號歸屬還未見完整報道。核磁共振技術是解析有機化合物結構的重要手段之一,該技術具有高靈敏度、對樣品破壞較小及可原位檢測等優點[9-10]。二維核磁共振技術對于解析有機化合物結構來說是一個有力的工具,廣泛應用于檢測藥物分子化學組成、結構及其與生物分子的相互作用[11-14]。利用核磁共振氫譜(1H NMR)、氫-氫相關譜(1H-1H COSY)、核磁共振碳譜(13C NMR)、DEPT譜、異核單量子相關譜(HSQC)、異核多鍵相關譜(HMBC)對阿伐他汀鈣的氫譜和碳譜進行全歸屬解析,更進一步掌握阿伐他汀鈣的分子結構,為阿伐他汀鈣的質量研究提供較為全面的參考依據。

阿伐他汀鈣結構式如下:

圖1 阿伐他汀鈣結構式

2 實驗

2.1 儀器

1H NMR、1H-1H COSY、13C NMR、DEPT、19F NMR、HSQC和HMBC譜均用Bruker AV 400MHz核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)測定,核磁共振譜儀裝備有5 mm BBFO寬帶探頭和控溫單元(VTU),實驗控制溫度為296 K。樣品溶于MeOD-d4,1H NMR 和13C NMR 的工作頻率分別為400.13 MHz和100.62 MHz,1H 90°脈沖寬度為14.55 μs,13C 90°脈沖寬度為9.61 μs,二維譜采用正檢測探頭進行反向模式檢測。

2.2 試劑

氘代試劑MeOD-d4(美國CIL公司)；阿伐他汀鈣(atorvastatin calcium )原料由華南農業大學周琢強課題組提供,經HPLC測試純度大于99%。

3 結果與討論

3.1 1H NMR和1H-1H COSY

該化合物的1H NMR譜圖見圖2,1H NMR(400 MHz,Methanol-d4) ：δ9.21(s,—NH),7.29(d,J=7.8Hz, 2 H), 7.22～7.16(m, 4H),7.13(d,J=7.8 Hz, 2H), 7.05(t,J=7.2 Hz, 2H),7.03～6.98(m, 4H),4.67(s,—OH, 1H),4.07(m, 2H),3.98～3.84(m, 2H),3.67(m, 1H),3.35(m,J=6.6 Hz, 1H),2.34(d,J=13.9 Hz, 1H),2.23(m, 1H),1.67(m, 2H),1.52(m, 1H),1.47(d,J=6.6, 6H),1.35(m, 1H)。

積分共得到34個氫,其中化學位移δ=9.21為單峰,處于低場并且積分面積較小,歸屬為酰胺的氫,應有1個H。δ=1.47的峰為雙重峰,積分面積為6個H,判斷應該屬于異丙基C-26和C-27的2個甲基的氫,結合1H-1H COSY(見圖3)，δ=1.47/δ=3.35交叉峰的出現,可以歸屬出δ=3.35的七重峰的氫為H-25。δ=4.67為單峰,積分面積為1個H,判斷應該屬于羥基的氫,從碳氫一鍵相關中亦可看出該峰無碳氫一鍵相關。從碳氫遠程相關譜中可看出C-1與δ=2.24,2.33存在遠程相關,從而可以判斷該峰為H-2；1H-1H COSY中,H-2與δ=4.06有交叉峰,從而說明δ=4.06為H-3(該峰面積積分為2,為H-3和H-6重疊所致)；H-3與δ=1.67有交叉峰,說明δ=1.67為亞甲基峰H-4；H-4與δ=3.91,3.67有交叉峰,其中δ=3.67為H-5,由于受羥基吸電子作用影響,其化學位移處于較低場；δ=3.91為H-6中的一個氫信號；H-5、H-6分別與δ=1.59存在交叉峰,說明δ=1.59為H-7。δ為6.98～7.29為芳香區的氫,積分面積為14,從氫譜譜圖裂分及積分可以看出存在對位取代或單取代基的多個苯環結構,苯環中質子的歸屬見后面的分析,具體的1H NMR和1H-1H COSY數據及歸屬見表1(δH為H的化學位移)。

圖2 阿伐他汀鈣1H NMR譜圖

圖 3 阿伐他汀鈣1H-1H COSY 譜圖表1 阿伐他汀鈣1H NMR和1H-1H COSY數據

碳位置δH耦合常數氫個數1H-1H COSY9.21sNH/217.29d,J = 7.8 Hz2H/10,157.24～7.15m4H/167.13d,J = 7.8 Hz2H/227.05t,J = 7.2 Hz2H/11,17,237.03～6.96m4H/4.67s,—OH2H/3/74.06m2HH-2,H-4/H-6

表1(續)

3.2 13C NMR、DEPT135、HSQC和HMBC

根據13C NMR譜圖(見圖4)。13C NMR(100 MHz, Methanol-d4)δ=182.15, 169.09, 163.66(d,JCF=246.10 Hz), 139.67,139.37, 136.23, 134.62(d,3JCF=7.65 Hz), 130.94, 130.10(d,4JCF=2.25 Hz),129.62,129.56,128.89,126.93,125.10,123.30,121.46,117.97,116.36(d,2JCF=21.59 Hz),69.21,69.18,44.92,43.78,42.18,40.61,27.53,22.83,22.81。一共有27種碳,羰基碳2種,芳基區16種,烷基區9種(其中2個峰重疊比較嚴重,不易區分,在DEPT135中觀察得比較清晰)。

圖4 阿伐他汀鈣13C NMR譜圖

在DEPT135譜圖(見圖5)中,季碳不出峰,CH、CH3的碳峰是正向的,而CH2的碳峰是負向的。由此可知,芳香區有10種季碳,8種CH碳。離氟原子近的碳在碳譜中會裂分,其偶合常數(JCF)隨著鍵的增加而減小,譜圖中δ為163.66(d,JCF=246.10 Hz)、134.62(d,3JCF=7.65 Hz)、130.10(d,4JCF=2.25 Hz)、116.36(d,2JCF=21.59 Hz)位置的峰型是分裂的,分別是連接氟原子的碳,鄰位和間位和對位的碳。δ=163.66 的兩重峰歸屬為C-12,由于受F原子的強電子誘導作用,在所有芳環最低場,δ=116.36的兩重峰歸屬為C-11,受其鄰位碳上F原子取代基推電子共軛作用,化學位移處在較高場,δ=134.62的兩重峰歸屬為C-10,受其間位碳上F原子取代基吸電子共軛作用,化學位移處在較低場。δ=130.10的兩重峰歸屬為C-9與阿托伐他汀內酯中相應碳的化學位移和偶合常數都接近[4,14]。δ為130.94、129.56、128.89和121.46處的譜峰峰高較強,為另外2個苯環上四類同等碳的峰。δ為121.46峰在HMBC 譜中與NH(δ=9.21)有遠程偶合,NH(δ=9.21)與δ為169.10、139.67有交叉峰,歸屬為C-19 和C-20,C-21受其鄰位C-19的酰胺取代基的推電子共軛作用,處于較為高場。在HSQC譜中,可相應歸屬得到H-21(δ=7.29),δ=128.89 峰在HMBC譜中與H-21存在遠程偶合,可歸屬為C-22。C-1(δ=182.15)與δ為4.06、2.33、2.24存在遠程相關,可相應歸屬得到H-3,H-2。H-2(δ2.33,2.24)與δ為69.18、43.78有遠程相關,可以相應歸屬得到C-3,C-4。從HSQC譜圖中,可以看到C-4與δ為1.59、1.34存在碳氫一鍵相關,HMBC譜圖中H-4與C-3(δ=69.18),C-5(δ=69.21)存在遠程相關。C-5與H-7(δ為4.06，3.91)、H-6(δ=1.66)存在遠程相關,結合HSQC譜圖可歸屬得到C-7(δ=42.17),H-7(δ為4.06，3.91)與δ為129.62、139.37存在遠程相關,從而可以歸屬得到C-8,C-24。δ為22.83、22.81與δ=3.35存在遠程相關,可相應歸屬得到C-26,C-27,H-25。H-25(δ=3.35)與δ為117.97、139.37有遠程相關,可相應歸屬得到C-18,C-24。

圖5 阿伐他汀鈣DEPT135譜圖

HSQC譜圖和HMBC譜圖分別見圖6和圖7，具體的13C NMR、DEPT、HSQC、HMBC數據及歸屬見表2(δc為C的化學位移，13CNMR結果)。

圖6 阿伐他汀鈣HSQC譜圖

圖7 阿伐他汀鈣HMBC譜圖表2 阿伐他汀鈣13C NMR、DEPT135、HSQC和HMBC數據

表2(續)

4 結語

核磁共振波譜儀引入現代化學分析技術實驗課程,將有機化學、有機波譜解析和儀器分析3門主要課程聯系起來,有利于學生將核磁共振知識融會貫通,有助于高校“三創”型人才的培養,有利于提高學生實驗操作技能,有利于激發學生探索科學的積極性,并為學生以后走上工作崗位奠定基礎[15]。通過1H NMR、1H-1H COSY、13C NMR、19F NMR、DEPT135、HSQC、HMBC等手段,對阿伐他汀鈣的結構進行了全面分析,明確歸屬了其所有的碳、氫信號峰。實驗測試完樣品數據后,傳授學生使用譜圖分析軟件Topspin2.1,在告知化合物分子式的情況下,要求學生利用軟件對該化合物數據進行全歸屬。通過本次教學實踐,使研究生及化學創新班學生加深了對核磁共振二維技術的認識,同時學會利用多種工具(查閱相關文獻、資料、書籍等)進行數據分析,學生的譜圖解析能力得到了有力地提升。