結直腸癌miR—200a與miR—92a表達水平及其與臨床病理特征的關系

楊新輝　趙為民　達熱拜·熱達提

[摘要] 目的 研究miR-200a、miR-92a在結直腸癌中的表達水平及其與患者臨床病理特征的關系。 方法 選取2011年2月～2012年8月在新疆醫科大學附屬腫瘤醫院接受手術治療的結直腸癌患者60例，采集結直腸癌組織與癌旁組織標本各60例。采用原位分子雜交技術檢測上述標本中miR-200a表達陽性率，采用實時熒光定量PCR法檢測上述標本中miR-92a表達情況。分析miR-200a及miR-92a表達情況與結直腸癌患者的臨床病理特征相關性。隨訪5年，根據生存狀態分為存活組與死亡組，比較兩組患者miR-200a、miR-92a表達情況差異。 結果 結直腸癌組織中miR-200a表達陽性率及miR-92a相對表達明顯高于癌旁組織（均P < 0.05）。中高分化、TNM Ⅰ～Ⅱ期結直腸癌患者miR-200a表達陽性率明顯低于低分化、TNM Ⅲ～Ⅳ期的結直腸癌患者，分別為40.00%（18/45）比73.33%（11/15）、58.06%（18/31）比86.21%（25/29），差異均有統計學意義（均P < 0.05）。而TNM Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移結直腸癌患者miR-92a相對表達量均明顯低于TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移患者（均P < 0.05）。隨訪5年，生存組21例，死亡組39例。存活組miR-200a表達陽性率及miR-92a相對表達量均明顯低于死亡組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。 結論 結直腸癌組織的miR-200a、miR-92a高表達，與病情嚴重程度及預后密切相關。

[關鍵詞] 結直腸癌；miR-200a；miR-92a；臨床病理特征；預后評估

[中圖分類號] R735.34 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（a）-0063-05

[Abstract] Objective To analyze the expression of miR-200a and miR-92a in colorectal cancer and the relation of clinicopathological features. Methods The 60 patients with colorectal cancers in Affiliated Tumor Hospital， Xinjiang Medical University for surgical treatment from February 2011 to August 2012 were collected. And the 60 colorectal cancer tissue specimens and paracancerous tissues were achieved in patients with colorectal cancer respectively. The positive expression rates of miR-200a in colorectal cancer tissues and paracancerous tissues were detected by in situ hybridization technique. The expression levels of miR-92a in colorectal cancer tissues and paracancerous tissues were detected by real-time PCR. The relativities of the expression of miR-92a and miR-200a and the clinicopathological features were analyzed. Follow-up 5 years， all patients with colorectal cancers were divided into survival group and death group according to the survival status of patients. The expression levels of miR-92a and miR-200a were compared between two groups. Results The positive rate of miR-200a and the expression level of miR-92a in colorectal cancer tissues were significantly higher than in paracancerous tissues （all P < 0.05）. The positive expression rates of miR-200a in the colorectal cancer patients of the middle and high degree of differentiation and TNM stage Ⅰ-Ⅱ were significantly lower than those of the low degree of differentiation and TNM stage Ⅲ-Ⅳ， which were 40.00%（18/45） vs. 73.33%（11/15）， 58.06%（18/31） vs. 86.21%（25/29） （all P < 0.05）. The relative expressions of miR-92a in colorectal cancer patients of the TNM stage Ⅰ-Ⅱ and without lymph node metastasis were significantly lower than those of the TNM stage Ⅲ-Ⅳ and lymph node metastasis， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Follow-up 5 years， the survival group had 21 cases and death group had 39 cases. The positive rate of miR-200a and the relative expression of miR-92a in survival group were significantly lower than death group， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion The expression levels of miR-200a and miR-92a are highly in colorectal cancer， and are closely associated with the severity and prognosis.

[Key words] Colorectal cancer； miR-200a； miR-92a； Clinicopathological features； Prognosis evaluation

結直腸癌發病早期具有較強的隱匿性，具有較高的發病率，預后不良[1]。其中早期結直腸癌患者的5年生存率可達90%，而晚期與發生轉移的結直腸癌患者5年生存率在15%以下[2-3]。因此，尋找一種有效的方式對結直腸癌患者進行診斷評估顯得尤為重要。本文通過研究miR-200a、miR-92a在結直腸癌中的表達與臨床病理特征關系，旨在為臨床診治提供數據支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年2月～2012年8月在新疆醫科大學附屬腫瘤醫院接受手術的結直腸癌患者60例，分別采集患者結直腸癌組織標本與癌旁組織標本各60例。其中男36例，女24例；年齡44～78歲，平均（65.4±10.3）歲；腫瘤直徑3～7 cm，平均（4.6±1.3）cm；分化程度：低分化15例，中高分化45例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期29例；浸潤深度：T1～T2有18例，T3～T4有42例；有淋巴結轉移30例，無淋巴結轉移30例。納入標準：①均符合WHO關于結直腸癌的診斷標準，并經手術病理檢查確診為結直腸癌；②均采取手術治療；③術前未接受放化療以及其他抗腫瘤治療。排除標準：①合并其他腫瘤；②術前接受過抗腫瘤治療。所有患者均知情并簽署了同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 采用原位分子雜交技術檢測標本中miR-200a的表達[4] 具體如下：組織切片行常規處理，同時滅活內源性酶。取3%胃蛋白酶完全消化后，1%多聚甲醛進行固定10 min，蒸餾水清洗3次，加入預雜交液20 μL，38℃恒溫箱中培養4 h。滴入含地高辛標記的寡核苷酸探針及20 μL預雜交液[5]。38℃恒溫箱中雜交過夜，分別取37℃的2×SSC洗滌2次，5 min/次；0.5×SSC洗滌1次；0.2×SSC洗滌1次。加入封閉液及生物素化鼠抗地高辛，在37℃下反應60 min，PBS洗滌4次；滴加SABC反應20 min，PBS洗滌3次；滴加生物素化過氧化酶繼續反應20 min，PBS洗滌4次，DAB顯色，蘇木精復染，予以脫水透明封片[6]。以探診稀釋液替代探診為陰性對照組，用已知陽性切片為陽性對照。

1.2.2 采用實時熒光定量逆轉錄PCR法檢測標本中的miR-92a表達情況 具體方式如下：嚴格按照Trizol試劑說明書對結直腸癌組織中的總RNA進行提取[7]，并參照RNA逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄處理。PCR反應條件如下：42℃ 60 min，70℃ 10 min。取1 μL的cDNA進行PCR擴增，反應條件如下：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，40個循環。操作時嚴格做好實驗室及操作臺面的質控措施。其中miR-92a表達情況采用絕對定量法進行計算，試驗重復3次，取平均值。

1.3 評價標準

miR-200a以細胞質中發現黃色或棕黃色顆粒為陽性，并采用半定量積分法對結果進行判定[7]：①根據著色細胞染色強度評分：0分無著色；1分淡黃色；2分棕黃色；3分棕褐色。②根據陽性細胞數占比評分：1分陽性細胞數占比≤10%；2分陽性細胞數占比>10%～25%；3分陽性細胞數占比>25%～50%；4分陽性細胞數占比>50%，兩項評分乘積為最后積分，積分為0～2分為陰性，3～12分為陽性[7]。

1.4 觀察指標

比較結直腸癌與癌旁組組織中的miR-200a、miR-92a表達情況，分析miR-200a、miR-92a表達與結直腸癌患者臨床病理特征關系，對比結直腸癌5年存活組患者與死亡組患者miR-200a、miR-92a表達情況。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，正態分布的計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，非正態分布的計量資料以中位數（M）四分位數間距（P25，P75）表示，予以非參數H檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織與癌旁組織miR-200a、miR-92a表達情況比較

結直腸癌組織中miR-200a表達評分及miR-92a相對表達明顯高于癌旁組織（P < 0.05）。見表1、圖1。

2.2 miR-200a在結直腸癌表達與臨床病理特征關系分析

中高分化、TNMⅠ～Ⅱ期結直腸癌患者的miR-200a表達陽性率分別為40.00%（18/45）、58.06%（18/31），均明顯低于低分化、TNM Ⅲ～Ⅳ期的73.33%（11/15）、86.21%（25/29）（P < 0.05）。見表2。

2.3 miR-92a在接直腸癌中的表達與臨床病理特征關系分析

TNMⅠ～Ⅱ期、無淋巴結轉移結直腸癌患者的miR-92a相對表達量均明顯低于TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移者（P < 0.05）。見表3。

2.4 結直腸癌患者5年生存情況與miR-200a、miR-92a表達的關系

結直腸癌5年存活組患者miR-200a表達陽性率及miR-92a相對表達量均明顯低于死亡組（P < 0.05）。見表4。

3 討論

隨著我國人們生活水平的不斷提高以及飲食習慣的逐漸改變，結直腸癌的發病率與病死率均呈逐年上升趨勢[8-9]，其癌變的發生、進展是一種多基因、多步驟的復雜過程，因此深入研究結直腸癌的具體發病機制，對臨床結直腸癌的早期診斷、指導治療以及預后評估均有極其重要的意義[10-11]。而miRNA是一類存在于真核生物中的非編碼小分子RNA，其主要作用是通過與靶mRNA的3，-UTR進行互補配對[12-13]，從而對蛋白合成進行抑制或促進mRNA的降解，進一步在轉錄后水平對目的基因表達進行調控[14-16]。

本研究發現，結直腸癌組織中miR-200a表達陽性率以及miR-92a相對表達量均明顯高于癌旁組織，說明了miR-200a與miR-92a可能在結直腸癌的發生、發展過程中發揮著至關重要的作用。此外本研究也提示了miR-200a在結直腸癌組織中的表達情況與分化程度和臨床分期存在密切相關，可能在結直腸癌的進展過程中發揮著重要作用。因此，在臨床工作中可通過對miR-200a表達情況進行檢測，從而可能對結直腸癌進行早期診斷，明確患者病情嚴重程度，從而合理制訂治療方案。另外，本研究提示了miR-92a可能參與了結直腸癌的病情進展以及淋巴結轉移過程，這一點與國外研究結論是相一致的[17-18]。因此在臨床工作中可通過對miR-92a表達情況進行檢測，進一步有效評估患者病情嚴重程度以及淋巴結轉移情況，為臨床治療方案的制訂提供參考信息。本研究結果還顯示了結直腸癌5年存活組患者miR-200a表達陽性率以及miR-92a相對表達量均明顯低于死亡組，這提示了miR-200a與miR-92a表達與結直腸癌患者的預后存在密切相關，這一點也得到國外臨床研究的證實[19-20]。臨床上可通過對上述兩項指標表達情況進行檢測，從而對結直腸癌患者進行預后評估。且上述兩項指標表達越高，患者預后越差。

綜上所述，miR-200a、miR-92a在結直腸癌均存在明顯高表達，且與患者病情嚴重程度及預后存在密切相關。可通過對上述兩項指標表達情況進行檢測，從而對結直腸癌患者進行診斷、預后評估。由于本研究尚存在樣本量不足的缺陷，從而可能導致影響結果可信度，因此本研究結果應在后繼的多中心大樣本研究中予以進一步證實。

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（收稿日期：2017-12-24 本文編輯：任 念）