巨噬細胞和肺微血管內皮細胞對煙曲霉作用的研究

宋珺　韓菁　孫越

[摘要] 目的 探討巨噬細胞和肺微血管內皮細胞對煙曲霉作用。 方法 構建小鼠巨噬細胞株J774細胞煙曲霉感染的體外模型和人肺微血管內皮細胞（HPMVECs）煙曲霉感染的體外模型，利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察共培養體系。 結果 J774細胞對煙曲霉具吞噬作用，但在共培養24 h的動態觀察中，并未觀察到HPMVECs內化煙曲霉，僅觀察到煙曲霉的感染導致HPMVECs形態的變化和細胞完整性的破壞。 結論 J774細胞對煙曲霉具吞噬作用，HPMVECs無內化煙曲霉的作用，煙曲霉感染可導致HPMVECs形態的變化和細胞完整性的破壞。

[關鍵詞] 巨噬細胞；肺微血管內皮細胞；煙曲霉

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（a）-0018-03

[Abstract] Objective To investigate effect of macrophages and pulmonary microvascular endothelial cells （HPMVECs） on Aspergillus fumigatus. Methods In vitro models of Aspergillus fumigatus-treated HPMVECs and Aspergillus fumigatus-treated J774 cells were established， confocal laser scanning microscope was used for detection of co-cultures. Results Aspergillus fumigatus were phagocyted by J774 cells. However， Aspergillus fumigatus were not internalized by HPMVECs， onlu morphology change and integrity compromise were observed on Aspergillus fumigatus-treated HPMVECs. Conclusion J774 cells phagocytes Aspergillus fumigatus. HPMVECs can't internalize Aspergillus fumigatus. Aspergillus fumigatus can cause morphology change and integrity compromise in HPMVECs.

[Key words] Macrophages； Pulmonary microvascular endothelial cells； Aspergillus fumigatus

在真菌感染中，曲霉菌是僅次于念球菌的重要致病菌[1-2]。導致人類疾病的主要曲霉菌是煙曲霉、黃曲霉和黑曲霉，人類曲霉菌病95%以上為煙曲霉感染引發[1.3]。巨噬細胞屬于免疫細胞，在先天性和后天性免疫應答過程中起著關鍵作用。另外，侵襲性肺曲霉病的主要特征是煙曲霉菌絲侵襲血管。目前，煙曲霉與巨噬細胞（或血管內皮細胞）的相互作用成為學者們普遍關注的研究熱點之一[1，4-6]。人肺微血管內皮細胞（HPMVECs）是肺組織的重要細胞，存在于循環血和實質臟器細胞之間，既是構成血管通透性的主要屏障，又是代謝功能復雜的炎癥細胞，對維持肺血管的完整性具有特殊意義[7-9]。我們已經完成的研究表明，煙曲霉感染能引發HPMVECs分泌多種促炎因子[10]。然而，煙曲霉感染后，巨噬細胞和HPMVECs對煙曲霉有著何種作用，目前尚不清楚。在本研究中，我們擬建立煙曲霉與巨噬細胞（或HPMVECs）的共培養體系，對上述問題進行研究。

1 材料與方法

1.1 煙曲霉菌孢子懸液制備

取煙曲霉菌菌株（AF293）接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，37℃培養箱培養3 d，收集分生孢子懸液，通過8層無菌紗布過濾以去除菌絲，PBS液清洗5次，轉入離心管中離心，棄上清，孢子重懸于PBS液中，計數后離心，重懸于PBS中，備用。帶有綠色熒光蛋白（GFP）的孢子通過電轉化法獲得。

1.2 細胞培養

HPMVECs的培養參照文獻[10]，培養液為專用內皮細胞培養液，J774細胞的培養液為DMEM培養液。于傳代培養第5代，細胞達90%底壁后，上述細胞給予煙曲霉菌孢子處理。

1.3 細胞處理以及激光共聚焦掃描顯微鏡觀察

細胞用胰酶消化后，用培養液重懸，取細胞懸液分別滴到鋪于培養孔板中的細胞爬片上，30 min 后，補加完全培養液，置于37℃，5%CO2培養箱中培養6 h左右（讓其貼壁更牢），然后將GFP標記的煙曲霉菌孢子刺激HPMVECs和小鼠巨噬細胞J774細胞，分別在2、4、8、16、24 h和0.5、2 h，用PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定（室溫）1.5 h，PBS清洗3遍，分別用羅丹明-鬼筆環肽（Rhodamine phalloidin）室溫孵育30 min，取出細胞爬片，用PBS 漂洗3遍，另外，于J774細胞，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色3 min，后PBS漂洗3遍，封片劑封片（有細胞一面對著載玻片），激光共聚焦掃描顯微鏡觀察并拍照。本實驗中，羅丹明-鬼筆環肽與胞漿內肌動蛋白（F-actin）結合而發紅光，DAPI與細胞核結合發藍光，攜帶GFP的孢子發綠光。

2 結果

2.1 煙曲霉的培養

煙曲霉菌菌株AF293于PDA培養基上，經37℃培養箱培養3 d后于普通顯微鏡下可見典型的煙曲霉圓形厚壁孢子和芽孢。見圖1。

2.2 HPMVECs的形態學觀察

HPMVECs用培養液接種于培養瓶中，培養24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，可見融合的單細胞層具有血管內皮細胞典型的鋪路石樣形態，但過度融合生長會因細胞過于緊密而呈現細長紡錘形。見圖2。

2.3 小鼠巨噬細胞J774細胞的形態學觀察

小鼠巨噬細胞株J774接種于培養瓶中，培養24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，可見貼壁生長的細胞呈單核細胞/巨噬細胞樣，圓形或多角形。見圖3。

2.4 建立煙曲霉與小鼠巨噬細胞株J774細胞（或HPMVECs）的共培養體系，探討J774細胞（或HPMVECs）對煙曲霉的作用

J774細胞與煙曲霉共培養至0.5、2 h時，可見J774細胞均存在GFP陽性染色（圖4，見封三），表明孢子被J774細胞吞噬。HPMVECs與煙曲霉共培養24 h的動態觀察中，未見煙曲霉被HPMVECs內化，然而，與對照組比較，隨著培養時間的延長，煙曲霉處理組HPMVECs出現形態的變化和細胞完整性的破壞（圖5、6，見封三）。

3 討論

本研究中我們成功構建HPMVECs煙曲霉感染的體外模型和小鼠巨噬細胞株J774細胞煙曲霉感染的體外模型，并觀察到J774細胞對煙曲霉的吞噬作用，但在共培養24 h的動態觀察中，我們并未觀察到HPMVECs內化煙曲霉，僅觀察到煙曲霉的感染可以導致HPMVECs形態的變化和細胞完整性的破壞。

巨噬細胞屬于免疫細胞，在先天性和后天性免疫應答過程中起著關鍵作用，它可以提呈抗原，吞噬、殺死胞內微生物或腫瘤細胞以及調節促炎和抗炎細胞因子的釋放等[11-12]。巨噬細胞作為免疫防御的第一道防線，對機體抵抗煙曲霉孢子侵襲具有重要作用[13-14]。在本研究中利用激光共聚焦掃描顯微鏡我們觀察到巨噬細胞對煙曲霉的吞噬。利用綠色熒光蛋白標記的煙曲霉感染巨噬細胞，我們可以在激光共聚焦掃描顯微鏡的視野中觀察到煙曲霉顯示清晰的綠色熒光，有利于觀察孢子侵入宿主細胞的過程。既往研究表明，除巨噬細胞對病原微生物具有吞噬作用外，非專職吞噬細胞也可以主動內化病原微生物[1，5-6]。研究者以人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）為研究對象，觀察到一定時間內有50%煙曲霉孢子內化進入HUVECs[5]。HPMVECs和HUVECs對煙曲霉的作用差異可能主要由于HPMVECs和HUVECs來源于不同的血管床，存在多方面的異質性。與巨噬細胞吞噬煙曲霉類似，煙曲霉對血管內皮細胞的侵襲、黏附涉及很多分子的參與[15-17]。目前研究較多的是內皮細胞表面的鈣黏蛋白。白色念珠菌表面的凝集素同源物Als3為跨膜蛋白，其膜外存在特定的β折疊結構，該蛋白能與內皮細胞表面的鈣黏蛋白結合，從而介導白色念珠菌進入宿主細胞[18-20]。

綜上所述，在本研究中我們利用表達綠色熒光蛋白的煙曲霉感染巨噬細胞（J774細胞）和HPMVECs，觀察到巨噬細胞具有對煙曲霉的吞噬作用，而HPMVECs對煙曲霉不具有內化作用，但引起HPMVECs結構完整性的破壞，在后續研究中我們將繼續探討煙曲霉與巨噬細胞（或HPMVECs）的相互作用及其機制。

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（收稿日期：2018-01-26 本文編輯：任 念）