兔腰椎間盤髓核部分摘除纖維環縫合模型建立與MRI分析

蔡碰德　顧恩毅　薛武祥　楊志　蘇淑玲　鄭忠

[摘要] 目的 建立兔腰椎間盤髓核部分摘除纖維環縫合模型并進行MRI分析。方法 2017年5—9月，選用福建中醫藥大學動物實驗中心新西蘭白兔14只，模型組及對照組各7只，沿右腹直肌外緣與腰背肌間隙進入L2～3椎體前緣。模型組縱形切開纖維環，針刺使髓核突出，然后縫合纖維環， 對照組未切開纖維環直接逐層閉合手術切口。術后2、4、12周分別于兩組椎間盤（L2～3）行MRI掃描并進行Pfirrmann分級，術后12周處死并解剖動物檢查對照組纖維環縫合的可靠性。 結果 術后2、4、12周作為對照組的L2～3 椎間盤Pfirrmann分級前后無明顯變化（Z=0， P=1.0）， 而模型組相應節段的椎間盤從術后2、4、12周開始即出現T2 加權像信號Pfirrmann分級逐漸增高（Z=-3.44，P<0.01；Z=-2.70，P<0.01），其與對照組對比均差異有統計學意義（Z=-3.60，P<0.01；Z=-3.44，P<0.01； Z=-3.5，P<0.01）。術后12周解剖動物發現模型組所有動物椎間盤纖維縫合線結均無脫落、松動現象。 結論 應用纖維縱切、針刺髓核，縫合纖維環法可獲得可靠的新西蘭大白兔椎間盤髓核部分摘除纖維環縫合模型，可通過MRI早期加以證實。

[關鍵詞] 髓核摘除；纖維環縫合；動物模型；新西蘭大白兔

[中圖分類號] R445 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）03（c）-0001-05

Establishment and MRI Analysis of the Anular Sutured Model after Partial Removal of Nucleus Pulposus of Lumbar Intervertebral Disc in Rabbits

CAI Peng-de， GU En-yi， XUE Wu-xiang， YANG Zhi， SU Shu-ling， ZHENG Zhong

Department of Orthopedics， Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University， Fuzhou， Fujian Province， 350007 China

[Abstract] Objective To establish MRI analysis of the anular sutured model after partial removal of nucleus pulposus of lumbar intervertebral disc in rabbits. Methods 14 New Zealand white rabbits from May to September 2017 in the Animal Experimental Middle School of Fujian University of Traditional Chinese Medicine were selected and divided into the model groups and control group with 7 cases in each. Along the space of outer margin of right obliquus externus abdominis and dorsal lumbar muscle exposure the front edge of L2 to 3. The model group underwent the longitudinal incision of the anular and acupuncture to the nucleus pulposus， in the control group， the anular was not cut and then for the direct closure surgery. In the 2，4，12 weeks after surgery， L2 to 3 was examined by MRI and then for Pfirrmann grading. In 12 weeks after operation， the animals in the model group were killed to examine the reliability of suture. Results The Pfirrmann grade of L2 to 3 disc in the control group in 2， 4， 12 weeks after operation was not significantly changed（Z=0， P=1.0）.In the model group， T2 weighted imaging signal began to appear of the corresponding segments of intervertebral disc since 2， 4， 12 weeks after operation（Z=-3.44， P<0.01； Z=-2.70， P<0.01）. the Pfirrmann grade was significantly higher than that in the control group （Z=-3.60， P<0.01； Z=-3.44， P<0.01；Z=-3.5，P<0.01）.In 12 weeks after operation， no shedding or loosing was found in all the intervertebral disc suture lines in the model group. Conclusion The anular sutured model after partial removal of the nucleus pulposus of the intervertebral disc of New Zealand white rabbits can be obtained by fiber longitudinally cutting and acupuncture of nucleus pulposus suture， which can be confirmed by early MRI.

[Key words] Nucleus pulposus excision； Anular suture； Animal model； New Zealand white rabbit

腰椎間盤突出導致的腰腿疼痛是臨床十分常見的腰椎退行性疾病，單純髓核摘除術是手術治療該疾病的首選方法。然而，術后復發是患者和脊柱外科醫師共同關注的難題，其發生與術后盤內遺留髓核組織、纖維環裂口愈合能力差、腰椎不穩定等因素密切相關[1-2]。因此，有學者提出腰椎間盤髓核摘除后縫合修復破裂的纖維環可能能夠減少術后復發的概率，并有相關文獻報道支持這一觀點[3-5]。然而， 廣泛的臨床應用還需要大量的動物實驗來證明，建立一種可行性強、安全有效、可重復性好的實驗動物模型用于后期的研究十分必要。2017年5—9月，該課題組選用14只新西蘭大白兔作為研究對象，采用銳月刀切開、結合針刺絲線縫合的方法建立兔腰椎間盤髓核部分摘除，纖維環縫合的模型并應用MRI掃描進行驗證，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及造模方法

采用清潔級健康雄性3個月月齡新西蘭大白兔14只，體重為1.2～1.5 kg。用小動物麻醉機（型號：R540IE）面罩吸入麻醉，麻醉劑為99.9%異氟烷（批號：21717 0701），麻醉誘導氣體流量為4.5～5 L/h，持續吸入氣體流量為3.0～4.0 L/h。

實驗動物采用半側臥位，術側軀干冠狀面與手術臺水平面成45°（如圖1），下方墊一厚度約6.0 cm的軟墊使術側腰椎間隙增大（如圖2）。以平肋弓下緣（腰2～3椎體間隙平面），后正中旁開2.0 cm處為中心做一長約6.0 cm的縱向切口。于腹外斜肌外側緣與腰背肌間隙進入，觸及肋骨辨別胸12椎體，向下推移2個椎體即為腰2～3椎體間隙。拉鉤牽拉腰2椎體橫突，另一拉鉤下壓腹膜及腹腔臟器，剝離椎體前緣的軟組織顯露腰2～3椎體間隙側前方。對照組（7只）至此逐層閉合切口，模型組（7只）繼續以下操作：在腰2～3椎體間隙側前方用20號尖刀片沿脊柱縱軸逐層切開前縱韌帶、纖維環，用20 mL注射器針頭刺入椎間盤內并輕微挑撥直至見部分膠凍樣半透明的髓核組織溢出。清除上述的髓核組織，用5-0不可吸收縫線縫合裂口并打結。沖洗切口，縫合腰背肌及腹外斜肌的筋膜、皮膚，無菌敷料覆蓋手術切口，終止吸入麻醉，實驗動物送入動物房麻醉復蘇。

1.2 磁共振（MRI）掃描與Pfirrmann分級

分別于術后2、4、12周應用GE Signa Advantage 115 T對兩組兔腰椎L2～3節段行T2加權像（T2WI）掃描。掃描參數如下：序列重復時間/ 回波時間（TR/TE） T2 加權像為5 000/128 ms，層厚1 mm，層間距1 mm，所有MRI影像資料由3位資深MRI醫師盲法閱片并按Pfirrmann分級法進行評估分級，共分為Ⅰ～Ⅴ級，意見不一致時通過討論定級[6]。

1.3 縫合處觀察

模型組術后12周進行MR檢查后處死動物，解剖檢查椎間盤纖維縫合線結是否有脫落、松動現象。

1.4 統計方法

采用SPSS 17.0統計學軟件處理數據，Pfirrmann分級實驗結果為等級資料，采用非參數秩和檢驗（Mann-Whitney）進行兩組間差異比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MRI Pfirrmann分級

術后2、4、12周的兔腰椎MRIWI2顯示，對照組的L2～3椎間盤T2加權像始終呈高強度信號（Z=0， P=1.0），模型組從術后2周開始椎間盤髓核信號強度呈進行性降低趨勢， Pfirrmann分級逐漸增加 （Z=-3.44，P<0.01；Z=-2.70，P<0.01）（表1），說明造模后時間越長，髓核信號強度降低越明顯（如圖3）。術后2、4、12周磁共振（T2WI）掃描椎間盤信Pfirrmann分級模型組明顯高于對照組，統計學分析差異有統計學意義（Z=-3.60，P<0.01；Z=-3.44，P<0.01； Z=-3.5，P<0.01）。

2.2 縫合線結檢查

術后12周處死動物，檢查發現所有椎間盤纖維縫合線結都無脫落、松動現象（圖4）。

3 討論

腰椎間盤突出行髓核摘除術后復發是影響該術式療效的最主要因素，有部分學者的臨床及動物實驗研究表明，髓核摘除術后如果條件允許給予行纖維環縫合將有利于減少術后復發[7-9]，然而這尚未得到臨床大量病例的應證。建立較為理想的實驗動物腰椎間盤髓核突出纖維環縫合模型，可便于后期開展比較髓核摘除術后縫合纖維環與否的進一步研究，為是否臨床廣泛開展該術式提供更多的理論依據。

3.1 椎間盤突出髓核摘除纖維環縫合模實驗動物的選擇

理論上說猴、豬、犬、羊等哺乳動物是較為理想的動物模型來源，但是這些較為大型的動物價值昂貴、麻醉困難，飼養條件高、操作困難，有些還屬于國家保護動物，難以大量應用[10-11]。而大小鼠、豚鼠等小型實驗動物的腰椎過小，進行椎間盤髓核穿刺纖維環縫合十分困難。該實驗中應用的新西蘭大白兔雖為爬行動物不能完全模擬人類直立行走的腰椎間盤退變突出，但其飼養容易、腰椎間盤大小適中、麻醉簡單，造模的可行性好，重復性強，是目前建立腰椎間盤髓核突出纖維環縫合較為理想的動物模型。

3.2 該實驗模型的特征

①有別于其他研究報道模型建立采用兔耳緣靜脈注射麻醉藥物的方法，常因麻醉劑量掌握不好而導致實驗動物死亡。而該實驗模型采用的是兔呼吸道吸入麻醉的方式進行麻醉，先給予較大劑量麻醉氣體進行誘導麻醉，然后中等劑量的麻醉氣體進行持續麻醉，手術過程中可通過控制麻醉氣體的流量控制麻醉的深淺，麻醉的安全性高，該研究無一例實驗動物因麻醉過深發生死亡。②該實驗模型制作所采用的手術入路為兔腹外斜肌外側緣與腰背肌的間隙到達椎體前緣，不需剝離大量的肌肉組織而發生較大量出血，創傷較小，且手術區域顯露清晰，可操作性好，術者熟練該入路后可在20 min內完成所有模型建立操作。③先前有不少研究行腰椎間盤髓核突出造模采用的是針刺法，而該模型制作中髓核突出采用的是銳刀縱向切開前縱韌帶、纖維環，針刺使髓核組織溢出，然后進行縫合。有別于常見的針刺法，纖維環裂口較為整齊，有利于后期縫合。④在預實驗中本課題組曾采用傳統的打結方法閉合破裂的纖維環，發現該方法線結容易脫落而使縫合失效。后改良為帶張力的雙線打結方法，改方法通過對向牽拉縫線兩端可使線結更為牢固而不易發生脫落，造模12周后解剖實驗兔腰椎間盤未發現纖維環縫合處破裂，說明采用這一縫合打結方法十分可靠。

3.3 模型制備成功的鑒定標準

髓核突出或摘除后出現的椎間盤退變主要是軟組織的退變，應首選對軟組織敏感的磁共振進行檢查了解椎間盤的情況。研究發現T2 信號強度與椎間盤組織的含水量呈正相關， 信號強度隨含水量減少而減低，而T1 信號值對高密度組織比較敏感， 在退變椎間盤T1 中數值及影像變化均不明顯， 故該實驗未予采用[12]。該研究表明造模兩周即可通過磁共振T2系列掃描發現造模后的動物椎間盤信號出現降低，且隨著時間推移越加明顯， 這與上述的研究基本一致。此外，椎間盤退變后蛋白多糖含量和硫酸軟骨素/硫酸角質素之比顯著下降，其在T2WI上信號的減弱程度較椎間盤髓核更為顯著[13-14]。說明MRI不僅能夠從反映腰椎問盤在退變過程中形態變化，而且能夠反映退變過程中生物化學的變化。另外MRI具有高的軟組織分辨力、無骨偽影和放射性損傷的優點，無疑是建立腰椎間盤退變動物模型中首選的無損傷性檢查方法。而利用X線測量椎體間隙高度變化、脊柱側彎、椎體前后緣骨質生成等方法多為腰椎間盤突出后繼發腰椎退行性病變的后期表現，并不適合作為鑒定造模成功的首選方法。

3.4 展望

在該課題研究模型建立成功的基礎上，后期研究可針對比較實驗兔腰椎間盤髓核部分摘除縫合與否的生物力學、影像學、組織學差異等展開研究，也可對纖維環的不同修復方法如細胞因子、生物膠水、生物膜等進行可行性探討及療效評價。雖然該研究所建立的實驗兔腰椎間盤髓核突出纖維環縫合的模型較為理想，但其不能完全模擬人類腰椎間盤髓核向后突出壓迫硬膜囊神經根的狀態，后期可針對于此展開研究，通過改良入路、術式等制備一種更為符合人類該種脊柱脊髓疾病的動物模型。

[參考文獻]

[1] Hong X， Liu L， Bao J， et al. Characterization and Risk Factor Analysis for Reoperation After Microendoscopic Diskectomy[J].Orthopedics， 2015， 38（6）：e490-496.

[2] 王劍鋒，楊林.腰椎間孔鏡術后復發的原因分析及對策[J].武警醫學，2017，28（4）：366-368.

[3] Parker SL， Grahovac G， Vukas D，et al. Effect of an Annular Closure Device （Barricaid） on Same-Level Recurrent Disk Herniation and Disk Height Loss After Primary Lumbar Discectomy： Two-year Results of a Multicenter Prospective Cohort Study[J].Clin Spine Surg，2016，29（10）：454-460.

[4] Ledic D， Vukas D， Grahovac G， et al. Effect of anular closure on disk height maintenance and reoperated recurrent herniation following lumbar diskectomy： two-year data[J].J Neurol Surg A Cent Eur Neurosurg， 2015， 76（3）：211-218.

[5] 江新， 李峰， 潘海松. 可擴張脊柱微創通道下腰椎間盤突出癥髓核摘除后纖維環裂口的縫合修復[J].中國組織工程研究，2017，21（24）：3912-3917.

[6] Shao J， Yu M， Jiang L， et al. Differences in calcification and osteogenic potential of herniated discs according to the severity of degeneration based on Pfirrmann grade： a cross-sectional study[J].BMC Musculoskelet Disord，2016（17）：191.

[7] Yang CH， Chiang YF， Chen CH，et al. The effect of annular repair on the failure strength of the porcine lumbar disc after needle puncture and punch injury[J].Eur Spine J，2016，25（3）：906-912.

[8] 王言，孫超，黃博， 等. 檸檬酸-EDC/NHS 膠原凝膠修復破損纖維環[J].第三軍醫大學學報， 2016， 38（10）： 1078-1084.

[9] Bostelmann R， Steiger HJ， Cornelius JF. Effect of Annular Defects on Intradiscal Pressures in the Lumbar Spine： An in Vitro Biomechanical Study of Diskectomy and Annular Repair[J].J Neurol Surg A Cent Eur Neurosurg，2017，78（1）：46-52.

[10] 袁秋明， 徐寶山， 楊強， 等. 羊纖維環部分缺損動物模型的構建[J].天津醫藥， 2016，44（5）：582-585.

[11] 唐家國，于濱生. 腰椎椎間盤退行性變大動物模型的建立方法[J].脊柱外科雜志，2017，15（5）：314-318.

[12] Menezes-Reis R， Salmon CE， Carvalho CS， et al. T1ρ and T2 mapping of the intervertebral disk： comparison of different methods of segmentation[J].AJNR Am J Neuroradiol，2015，36（3）：606-611.

[13] Souza RB， Wu SJ， Morse LJ， et al. Cartilage MRI relaxation times after arthroscopic partial medial meniscectomy reveal localized degeneration[J].Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2015，23（1）：188-197.

[14] Choi JA， Gold GE. MR imaging of articular cartilage physiology[J].Magn Reson Imaging Clin N Am，2011，19（2）：249-282.

（收稿日期：2017-12-20）