黃腐酸對苜蓿固氮效率及產量的影響研究

邱小倩 許原原 王若楠 李寶珍 楊金水 袁紅莉

中國農業大學生物學院 北京100193

苜蓿營養價值高，含有豐富的礦物質、多種維生素、微量元素及胡蘿卜素，適口性好，是各種牲畜最喜食的牧草，被譽為“牧草之王”。自2012年國家實施“振興奶業苜蓿發展行動”計劃以來，我國苜蓿行業發展迅速，但優質苜蓿產量仍嚴重供不應求，預計到2020年全國優質苜蓿總需求量將達到610萬噸。此外，近年來化肥過量使用造成的土壤環境問題日益突出，豆科植物與根瘤菌共生能將自然界中植物難以直接利用的氮轉化為可直接利用的氨[1]，減少氮肥使用的同時，還起到改善土壤理化性質，提高土壤肥力的作用，對農業可持續發展具有重要意義。提高豆科植物與根瘤菌的結瘤固氮效率，增加豆科植物產量，不僅具有經濟價值，而且是解決化肥過量使用的有效途徑之一。

黃腐酸可以促進豆科植物結瘤固氮。早在1983年，Tan等[2]就發現黃腐酸可以使大豆、花生等豆科植物的根瘤干重增加。Rezazadeh等[3]也發現，噴施黃腐酸后豇豆的結瘤數增加了16.15%，根瘤的含氮量增加12.95%。欒白等[4]發現，適宜濃度的黃腐酸能提高大豆種子的萌發率，顯著提高其抗氧化酶的活性，促進種子的萌發。Gao等[5]通過差異蛋白質組學的方法發現微生物降解褐煤生成的黃腐酸可以加快大豆根瘤菌（Bradyrhizobium liaoningense CCBAU05525）的代謝和營養攝入，提高大豆根瘤菌的細胞密度，并且誘導根瘤菌nod基因的表達，最終促進大豆的結瘤固氮。

本研究在大田試驗條件下，對豆科牧草——紫花苜蓿進行噴施黃腐酸及接種根瘤菌處理，研究黃腐酸對苜蓿結瘤固氮及產量的影響，以期為黃腐酸在牧草種植上的大面積應用，以及減少氮肥施用條件下提高牧草產量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃腐酸

采用本研究室專利技術“微生物降解生產黃腐酸方法（ZL02158189.4）”[6]中描述的方法發酵生產黃腐酸。發酵后產物的提取方法如下：10 g褐煤發酵產物加入100 mL去離子水，攪拌12 h后，10000 rpm，15 min離心3次，上清液經真空抽濾進一步去除固體不溶物后，40 ℃烘干備用。

根據Gao等[5]研究結果確定黃腐酸的使用濃度為0.5 g/L。

1.1.2 試驗根瘤菌菌株

Sinorhizobium meliloti CCBAU01290，由中國農業大學根瘤菌研究中心提供，分離自內蒙古地區，經田間試驗證明能與紫花苜蓿（“敖漢”）高效結瘤固氮[7]。

1.1.3 苜蓿品種

“中苜一號”紫花苜蓿（Medicago sativa L.），購買自中國農業科學院畜牧研究所。

1.1.4 試驗地概況

試驗于2013—2015年在北京市順義區農業科學研究所基地（40°5′N，116°16′E）進行。經檢測，土壤有機質含量為14.2 g/kg，全氮含量為1.02 g/kg，堿解氮含量為121 mg/kg，有效磷含量為68.8 mg/kg，速效鉀含量為173 mg/kg，土壤pH為7.88。在苜蓿播種前平整土地，同時每畝地施加1250 kg有機肥作為底肥。

1.2 試驗設計及方法

1.2.1 試驗設計

苜蓿于2013年9月2日播種，行距30 cm，播種量1千克/畝，田間常規管理。試驗設3個處理：對照（噴施等量清水）；噴施黃腐酸；接種根瘤菌。每個處理5次重復，隨機分布，每個小區面積為20 m2。

1.2.2 方法

噴施黃腐酸處理：苜蓿播種后，將0.5 g/L的黃腐酸溶液按照每畝地50 L的量均勻噴灑到播種的溝穴內，然后再覆土。

接種根瘤菌處理：根瘤菌在YMA平板上活化2次后，接種至YMA液體培養基中培養3天，使菌體密度達到1010～1011cfu/mL。

接種方式：苜蓿播種到溝穴后，將適當稀釋后的菌懸液按照活菌數約107個/粒種子均勻噴灑到種子上（每畝地約需要150 mL菌劑），然后再覆土。

2015年第1次刈割（2015年5月22日）25天后，除對照外，各個處理在苜蓿根部再一次均勻噴施黃腐酸。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 樣品采集

在2013年11月6日，即苜蓿種植2個月后，在各個處理每個小區內隨機選取長勢大小一致的10株苜蓿，統計結瘤數并稱量根瘤鮮重，檢測苜蓿的結瘤情況。分別在2014年及2015年的5、7、8月苜蓿的開花期測定苜蓿產量（地上干重，共6次）；并測定2015年第1次刈割時根瘤的固氮酶活性。

1.3.2 測定方法

根瘤數及根瘤鮮重：每個小區取10株長勢大小一致的苜蓿，將帶有根瘤的根剪下，洗凈后放入密封袋中，帶回實驗室，用鑷子小心將根瘤摘下，統計數量，用分析天平稱重。

苜蓿產量：在每個小區內選取約2～3 m2的區域收割苜蓿直接測量鮮重，并從每份測產的樣品中隨機抽取約1 kg鮮苜蓿風干至恒重，計算干重，再換算為每公頃產量。

固氮酶活性：采用乙炔還原法測定[8]。[固氮酶活性=樣品乙烯峰面積×瓶體積×標準乙烯的量/（標樣乙烯峰面積×上樣體積×瘤重×反應時間）]。

2 結果與分析

2.1 不同處理對苜蓿結瘤的影響

在苜蓿種植2個月后，檢測了對照、噴施黃腐酸及接種根瘤菌處理的苜蓿根瘤數及根瘤鮮重。結果如圖1所示，與對照相比，接種根瘤菌后苜蓿根瘤數增加2.29倍，且差異顯著；噴施黃腐酸后使苜蓿根瘤數增加0.33倍，這說明黃腐酸在一定程度上促進了土著根瘤菌與苜蓿的結瘤。噴施黃腐酸處理的苜蓿根瘤鮮重最高，為對照的1.84倍。可見，黃腐酸對苜蓿結瘤的作用主要體現在根瘤大小上，即單個根瘤的重量上；而接種根瘤菌的處理，苜蓿根瘤鮮重與對照比雖然有所增加，但是差異不顯著。

綜上，噴施黃腐酸或接種根瘤菌對苜蓿的結瘤均有積極作用。

圖1 不同處理對苜蓿根瘤數（A）及根瘤鮮重（B）的影響Fig.1 Effects of different treatments on the number (A) and fresh weight (B) of alfalfa nodules

2.2 不同處理對苜蓿固氮酶活性的影響

苜蓿是多年生豆科牧草，根瘤菌的接種效果是否能持續多年一直是人們關心的問題。固氮酶活性能夠直接反應根瘤的固氮能力，因此我們選擇在第2年（2015年）第1次刈割時進行固氮酶活性的測定，以檢測所施加的黃腐酸及接種的根瘤菌是否仍能促進苜蓿的共生固氮效率。

圖2為不同處理對苜蓿根瘤固氮酶活性的影響。結果顯示，噴施黃腐酸和接種根瘤菌的2個處理的固氮酶活性顯著高于對照：噴施黃腐酸處理顯著提高了苜蓿根瘤的固氮酶活性，說明黃腐酸不僅促進土著根瘤菌與苜蓿結瘤，還可提高其單位質量根瘤的固氮效率，顯著提高土著根瘤菌與苜蓿的結瘤固氮效率；接種根瘤菌的處理，苜蓿植株固氮酶活性顯著高于對照，說明接種的根瘤菌在經過冬季低溫后，在翌年春天仍然能夠發揮一定的作用，且其固氮效率高于土著根瘤菌。

圖2 不同處理對苜蓿根瘤固氮酶活性的影響Fig.2 Effects of different treatments on nitrogenase activity of alfalfa nodules

2.3 不同處理對苜蓿產量的影響

苜蓿在開花期測定其產量，于2014年及2015年的5、7、8月共6次連續2年對苜蓿產量進行了測定。2014年苜蓿測產結果如表1所示，與對照的年產量16324.79 kg/hm2相比，噴施黃腐酸處理苜蓿年產量為21152.5 kg/hm2，增產達29.57%，而接種根瘤菌處理苜蓿年產量為18001.65 kg/hm2，增產10.27%。

2015年苜蓿測產結果如表2所示。對照處理苜蓿年產量為15934.22 kg/hm2；噴施黃腐酸處理苜蓿年產量為19176.39 kg/hm2，比對照增產20.35%；接種根瘤菌處理苜蓿年產量為20609.28 kg/hm2，比對照增產29.34%，增產效果明顯。由表2可以看出，在2015年6月重新補施黃腐酸后，與對照相比，第2次刈割苜蓿的產量雖沒有顯著增加，但第3次刈割的產量較對照而言明顯提高。也就是說，在苜蓿過冬后的春天，苜蓿返青時補施黃腐酸，能顯著增加第2年苜蓿的產量。對2年的產量進行統計可以發現，噴施黃腐酸及根瘤菌處理相比對照（年產量32259.01 kg/hm2）苜蓿分別增產25.02%和19.69%。以上結果說明，噴施黃腐酸及接種根瘤菌對苜蓿生長具有明顯的促進效果。

表1 2014年不同處理對苜蓿產量的影響Tab.1 Effects of different treatments on alfalfa yields in 2014

表2 2015年不同處理對苜蓿產量的影響Tab.2 Effects of different treatments on alfalfa yields in 2015

3 結論

噴施黃腐酸能夠促進土著根瘤菌與苜蓿結瘤，增加根瘤數及根瘤鮮重，同時可提高單位質量根瘤固氮酶活性，進一步增加苜蓿的固氮總量，2年使苜蓿增產高達25.02%，效果甚至好于接種根瘤菌，為苜蓿在大面積種植上施用黃腐酸奠定了基礎。今后，繼續研究同時噴施黃腐酸并接種根瘤菌對苜蓿生長的影響，對深入揭示黃腐酸促進苜蓿結瘤固氮機理具有重要的理論和實踐意義。