免疫親和層析凈化超高效液相色譜法測定玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量結果的不確定度評價

趙晶晶 張振華 劉 青 吳麗華 徐 艷 李 敏 劉維波

(西安市糧油質量檢驗中心1，西安 710003) (西安市農產品質量安全檢驗監測中心2，西安 710066) (商洛市疾病預防控制中心3，商洛 726000)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又名嘔吐毒素，是鐮刀菌屬，尤其是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌株分泌產生的次生代謝產物[1]，廣泛存在于小麥、玉米、大麥等霉變糧食作物及其制品中，在全球范圍內的檢出率和檢出量都很高[2-4]。這類毒素的化學性質穩定，在加工、儲存及烹調過程中很難被破壞，進入食物鏈后干擾核糖體肽基轉移酶的活性，抑制蛋白質的合成，破壞人和動物的免疫系統[5-8]。2015年國際食品法典委員會(CAC)規定未加工谷物中DON限量為2 000 μg/kg，谷物制品中DON限量為1 000 μg/kg，谷物基嬰幼兒食品中DON限量為200 μg/kg[9]，2017年我國食品安全標準規定谷物及其制品中DON的限量指標為1 000 μg/kg[10]。近年來，隨著 DON污染對農產品及畜牧生產的負面影響被逐漸認識，其含量分析已成為糧食監管部門對入庫、 出庫糧食作物的常檢項目之一[11]。由于DON的檢測需要經過樣品粉碎、提取、凈化、淋洗、濃縮、定容等一系列過程，每一步操作都會對結果產生影響。為了確保檢測結果的可信度，必須進行測量不確定度的評定。

不確定度是合理表征、賦予被測量值的分散性并與測量結果相聯系的參數[12]，是完整表達、科學評價檢測結果可信度的依據[13-14]。本實驗參照JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[12]和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[15]，通過GB/T 5009.111—2016《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》[16]第二法：免疫親和層析凈化高效液相色譜法，以玉米為例，對食品中的DON的測定進行不確定度評定，建立免疫親和層析凈化超高效液相色譜法測定食品中DON的不確定度評定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米樣品為市場隨機抽樣；DON標準品[質量濃度(100.00±0.3) μg/mL]pribolab公司；甲醇、乙腈(均為色譜純)德國Merck公司；聚乙二醇(分析純)天津科密歐化學試劑有限公司；水為一級水。

H-Class超高效液相色譜儀(配有紫外檢測器)：美國Waters公司； SE602F電子天平：奧豪斯儀器(上海)有限公司；DJFSD-70 粉碎磨：上海嘉定糧油儀器有限公司；Z32HK離心機：美國HERMLE公司；HY-4調速多用振蕩器：國華電器有限公司；HVF-1000型固相萃取裝置：陜西奧聯科技發展有限公司；TurbovapLV濃縮儀：瑞典 Biotage 公司；Milli-Q超純水機：默克化工技術(上海)有限公司； DON免疫親和柱：美國ROMER公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣品前處理

樣品制備、提取、凈化及色譜條件，參考GB/T 5009.111—2016《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》并結合DON免疫親和柱產品說明書。

具體過程如下：分取至少1 kg樣品，除雜，粉碎，過篩，使其粒徑小于0.5～1 mm，制成全麥粉；使用最小分度值為0.01 g的天平，準確稱取25.00 g樣品于100 mL的具塞三角瓶中加入5 g聚乙二醇，加水100 mL，混勻，置于振蕩器中振蕩30 min后，于10 000 r/min下離心5 min；準確移取2.0 mL上清液過免疫親和柱，用去離子水淋洗免疫親和柱2次，每次10 mL，待液體排干后，用甲醇洗脫3次，每次0.5 mL；收集全部洗脫液于50 ℃下氮吹至近干，加入2.0 mL流動相，渦旋30 s復溶，0.22 μm濾膜過濾后上機。

1.2.2 色譜條件

色譜柱： Waters-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相∶甲醇-水(20∶80，V/V)；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5.0 μL；檢測波長：218 nm。

2 結果與分析

2.1 數學模型的建立

用外標法計算玉米中DON的含量，其數學模型

見式(1)：

(1)

式中：X為樣品中DON含量/μg/kg；C為標準曲線得到的待測溶液中DON的質量濃度/μg/mL；V為樣品最終定容體積/mL；m為樣品的稱樣量/g；R為回收率校正因子。

2.2 不確定度來源分析

根據測定過程和數學模型的分析可知，免疫親和層析凈化超高效液相色譜法測定玉米中DON含量測定的不確定度主要來源于待測溶液中DON的質量濃度、樣品定容體積、樣品質量、回收率和重復性等因素，各相關不確定度如圖1所示。

2.3 分析和量化不確定度分量

2.3.1 測量重復性引入的不確定度u(frep)

重復性引入的不確定度，主要受實驗人員的熟練程度及儀器自身性能等因素影響[17]，包含了稱量的重復性、體積的重復性、檢測的重復性等，該不確定度屬于A類不確定度。為了獲得本次實驗整體重復性的不確定度，平行測定玉米樣品10次，測定結果見表1。

表1 重復性測定結果

圖1 DON含量測定的不確定度來源

2.3.2 回收率引入的不確定度u(R)

樣品前處理主要包括提取、離心、凈化、氮吹、復溶等步驟，引入不確定度的因素較多，逐一對各環節進行不確定評定相對困難。本實驗選用DON含量是1.41 mg/kg的玉米粉中嘔吐毒素成分分析標準物質進行5次實驗，結果見表2。

表2 DON加標回收率測定結果

2.3.3 待測溶液中DON物質的量濃度(C)引入的不確定度u(C)

C的不確定度主要由標準系列工作液配制帶來的不確定度和標準曲線擬合的直線求得C時產生的不確定度兩部分組成。標準系列工作液配制又包括儲備液的配制和標準系列工作液配制兩個過程。

2.3.3.1 儲備液配制過程引入的不確定度uC-1

準確吸取1.0 mL DON標準品(乙腈定容)至10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即為10.00 μg/mL的標準儲備液。

1)標準品質量濃度引入的不確定度uCS：根據標準物質證書，本實驗采用的DON標準品質量濃度CS=100.00 μg/mL，擴展不確定度U(CS)=0.3 μg/mL，(k=2)，按B類評定，屬于正態分布，其標準不確定度和相對標準不確定度分別是：

表3 儲備液配制過程中體積引入的不確定度

根據表3可知，標準儲備液配制過程中由體積引入的合成相對標準不確定度是：

因此，標準儲備液配制過程產生的相對標準不確定度是：

2.3.3.2 標準系列工作液配制過程引入的不確定度u(C-2)

準確移取2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mL標準儲備液于10 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度并充分混勻，得到2 000、1 000、500、200、100 ng/mL系列標準工作液。

表4 標準系列溶液配制過程引入的不確定度

標準曲線配制時使用的移液器刻度誤差符合JJG 646—2006 《移液器檢定規程》[23]的要求。標準溶液和樣品以流動相定容，屬于有機液體，體積膨脹系數α取1.0×10-3/℃計算[17]，標準系列工作液配制過程中由玻璃器具和溫度波動引入的不確定度見表4。

根據表4可知，由標準系列工作液配制過程產生的相對標準不確定度是：

2.3.3.3 校準曲線擬合引入的不確定度uC-3

采用5個不同質量濃度的DON標準溶液，分別用UPLC重復測定3次，得到相應的峰面積Ai，利用Excel軟件擬合得到線性回歸方程為Ai=aCi+b，其中a為斜率，b為截距，測定結果及計算數據見表5。

表5 標準曲線數據

選取2.3.1節中的樣品1待測液進行3次(m=3)平行測量，其測定結果見表6，則由標準工作曲線擬合所產生的不確定度如式(2)所示。

表6 樣品中DON含量平行測量結果

(2)

綜上所述，由待測溶液中DON物質的量濃度引入的合成相對標準不確定度是：

2.3.4 體積量取引入的不確定度u(V)

表7 體積量取引入的不確定度

根據表7可知，由樣品定容引入的相對標準不確定度是：

2.3.5 樣品質量(m)引入的不確定度um

m的不確定度主要來自于天平分辨力引入的不確定度um1、天平校準引入的不確定度um2和稱量過程中的隨機變化引入的不確定度um3。其中，um3已經包括在測量重復性因素ufrep。

2.3.5.1 天平分辨力引入的不確定度um1

2.3.5.2 天平校準引入的不確定度um2

因此，由電子天平稱量引入的合成相對標準不確定度是：

.001 67。

2.4 相對標準不確定度的合成

各不確定度分量相互獨立，不需要考慮分量間的相關性，則玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的合成相對標準不確定度是:

其中各分量匯總及對合成相對標準不確定度的相對貢獻見表8。

2.5 擴展不確定度及結果表示

依據JJF 1135—2005，對于大多數測量采用包含因子k=2(95%置信度)衡量，則玉米中DON含量的擴展不確定度U=urelX×X×2，由此得到免疫親和層析凈化超高效液相色譜法測定玉米中DON含量的結果，見表9。

表8 玉米中DON含量的相對標準不確定度分量與相對貢獻

表9 不確定度評定結果

3 結論

通過對超高效液相色譜法測定玉米中DON含量的不確定度各分量的評定可知，影響測定結果不確定度的因素主要是質量濃度、測量重復性、體積量取，其次為測量偏差和樣品稱量。其中質量濃度因素中貢獻最大的分量是標準曲線擬合，其次是標準系列工作液配制和儲備液配制，而樣品稱量引入的不確定度較小可以忽略不計。因此，在實際操作過程中選用更精密的量器具、增加標準系列工作液各個點的測量次數、增加平行樣的測定次數，改善標準曲線線性，減少由質量濃度和體積量取引入的不確定度；同時嚴格規范實驗操作，提高檢驗人員的熟練水平并定期對所涉儀器進行檢定以減少測量重復性和測量偏差引入的不確定度，從而保證檢測結果的準確性。