馬鈴薯皮黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究

江震宇 陳佳靜 葛宇飛 陳 卓 程林潤(rùn) 徐麗珊

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院1，金華 321004) (金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院2，金華 321017)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)俗稱土豆，茄科茄屬一年生草本植物。由于其產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)豐富，目前馬鈴薯已經(jīng)成為中國(guó)第5大糧食作物，2011年我國(guó)馬鈴薯種植面積達(dá)到542.67 萬(wàn)公頃，總產(chǎn)量8 835.02萬(wàn)t，占糧食總產(chǎn)量的15.51%[1]。

馬鈴薯皮是馬鈴薯加工和消費(fèi)中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)品，一般不被人們所利用。馬鈴薯皮的丟棄不僅導(dǎo)致了廢物處理問題，而且造成了食品行業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，馬鈴薯皮中富含黃酮類、生物堿、花青素、綠原酸等化合物[2-5]，其中黃酮類化合物具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂等多種保健功效[6-7]。

近年來(lái)，已有研究者對(duì)馬鈴薯皮黃酮進(jìn)行了初步的研究[8-10]，然而目前鮮見關(guān)于微波輔助提取馬鈴薯皮黃酮工藝的報(bào)道。微波輔助提取技術(shù)是國(guó)內(nèi)外常用的植物活性成分提取技術(shù)[11]，其主要是依靠微波場(chǎng)來(lái)加速活性成分的溶出。菜籽油是我國(guó)南方常見的食用油之一，其極易發(fā)生氧化，氧化產(chǎn)物對(duì)人體具有毒副作用。因此本實(shí)驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)法和響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取馬鈴薯皮黃酮的工藝條件，并通過(guò)測(cè)定馬鈴薯皮黃酮對(duì)DPPH·的清除能力及對(duì)菜籽油儲(chǔ)存過(guò)程中過(guò)氧化值的影響研究其抗氧化活性，以期為充分利用馬鈴薯資源，實(shí)現(xiàn)馬鈴薯皮的“廢物再利用”，開發(fā)綠色、安全、高效的天然馬鈴薯皮抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯(中薯3號(hào))：金華市農(nóng)科院，洗凈取其皮(厚度1～2 mm)，100 ℃殺青后60 ℃烘干，粉碎過(guò)篩備用。菜籽油：購(gòu)于榨油廠，選取新鮮的菜籽用物理方法壓榨而成，無(wú)任何添加成分。

蘆丁、維生素C(VC)等標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)：日本東京化成工業(yè)公司；AB-8大孔吸附樹脂：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、三氯甲烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純：金華醫(yī)藥公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW135粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海恒科技有限公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：瑞士布奇公司；MDS-8G微波消解儀：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；HWS28恒溫水浴鍋：上海恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 馬鈴薯黃酮提取液的制備

一定質(zhì)量的馬鈴薯皮粉和乙醇溶液，按一定液固比(mL∶g)，充分混合后進(jìn)行微波輔助提取。提取結(jié)束后，提取液于4 ℃，4 500 r/min離心10 min，取上清液定容，即得馬鈴薯皮黃酮提取液。

1.4 馬鈴薯皮黃酮含量的測(cè)定

采用硝酸鋁顯色法[12]，測(cè)定馬鈴薯皮提取液的黃酮含量。以蘆丁溶液濃度為橫坐標(biāo)， 510 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光度(y)與蘆丁濃度(x)(0～0.3 mg/mL)之間的關(guān)系為y=11.6x-0.002，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 6。吸取5.0 mL待測(cè)樣品液于10.0 mL試管中，加入0.2 mL 5% NaNO2溶液，混勻。靜置6 min后加入0.2 mL 10% Al(NO3)3溶液，混勻，靜置6 min，再吸取1.0 mL1 mol/L NaOH加入試管，混勻，靜置15 min，于510 nm處測(cè)定樣品的吸光值，根據(jù)式(1)，計(jì)算出黃酮含量。

(1)

式中:y為樣品于510 nm處的吸光度；n為樣品被稀釋的倍數(shù)；V為提取液的體積/mL；m為馬鈴薯皮粉末的質(zhì)量/g。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察提取溫度50、60、70、80、90 ℃；微波功率500、600、700、800、900 W；提取時(shí)間15、20、25、30、35 min；液固比(mL∶g)15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1；乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%對(duì)馬鈴薯皮黃酮得率的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析確定考察區(qū)間，以此作為響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的基礎(chǔ)。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定微波功率為700 W、提取時(shí)間為25 min，以黃酮得率為響應(yīng)值(Y)，以乙醇濃度(A)、液固比(B)、提取溫度(C)為自變量，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)建立模型分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以確定提取的最佳工藝條件。

1.7 馬鈴薯皮黃酮的制備及純化

按最佳工藝條件提取馬鈴薯皮黃酮，得到的提取液于50 ℃減壓濃縮近干，真空干燥，得馬鈴薯皮黃酮。取一定質(zhì)量的馬鈴薯皮黃酮將其完全溶解，加入2 g 活化后的AB-8大孔吸附樹脂，于恒溫振蕩器(28 ℃)振蕩吸附4 h，棄去未吸附的溶液，加入一定量的95%的乙醇溶液，于恒溫振蕩器(28 ℃)振蕩吸附2 h。收集解析液于50 ℃減壓濃縮近干，真空干燥，得馬鈴薯皮黃酮純化物，按照1.4的方法測(cè)定其黃酮含量。

1.8 體外抗氧化活性測(cè)定

1.8.1 DPPH·清除活性

參照Liu等[13]方法，將不同濃度的馬鈴薯皮黃酮溶液和VC溶液(陽(yáng)性對(duì)照)各1 mL與2 mL 0.15 mmol/L的DPPH·溶液(70%乙醇配制)混勻后，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i；1 mL 70%乙醇溶液與2 mL DPPH·溶液混勻后，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)c；將不同濃度的馬鈴薯皮黃酮和VC溶液各1 mL與2 mL 70%乙醇溶液混勻后，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)j，按式(2)計(jì)算清除率。

(2)

1.8.2 菜籽油抗氧化活性

1.8.2.1 馬鈴薯皮黃酮提取物對(duì)菜籽油過(guò)氧化值的影響

采用Schaal烘箱法進(jìn)行測(cè)定[14]，在裝有等質(zhì)量的菜籽油廣口瓶中分別加入油重0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的馬鈴薯皮黃酮，振蕩混勻，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，菜籽油為空白對(duì)照，置于(65±1) ℃的烘箱，24 h后測(cè)定菜籽油的過(guò)氧化值。根據(jù)上述結(jié)果，選取適合的黃酮濃度進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，在裝有等質(zhì)量的菜籽油廣口瓶中分別加入等質(zhì)量百分比的馬鈴薯皮黃酮和VC，以菜籽油為空白對(duì)照，每間隔24 h測(cè)定試樣的過(guò)氧化值。

1.8.2.2 過(guò)氧化值的測(cè)定

參照GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[15]中的4.2.2比色法進(jìn)行測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度(y)與鐵質(zhì)量(x)的標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系為y=0.030 36x-0.081 58，R2=0.998 07。相同方法測(cè)定樣品的吸光值，根據(jù)式(3)，計(jì)算過(guò)氧化值。

(3)

式中：c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中的鐵質(zhì)量/μg；c0為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到零管中的鐵質(zhì)量/μg；V1為樣品稀釋總體積/mL；V2為樣品測(cè)定取樣體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.9 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)值均為三次以上測(cè)定值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析，P<0.01為差異極顯著，0.01≤P≤0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1可知，隨著提取溫度的增加，馬鈴薯皮黃酮得率先增加后減小，在70 ℃達(dá)到最大值(5.69±0.21) mg/g，之后便迅速下降。當(dāng)微波功率由500 W上升到700 W時(shí)，馬鈴薯皮黃酮得率隨之而增加，在700 W時(shí)達(dá)到最大值(6.02±0.04) mg/g，800 W后含量趨于平緩，因此選取700 W為最佳微波功率。馬鈴薯皮黃酮得率隨著提取時(shí)間的增加先增加后緩慢減少，在25 min時(shí)達(dá)到最大值(6.03±0.49) mg/g，據(jù)此，擬定最佳的提取時(shí)間為25 min。當(dāng)液固比在15∶1～20∶1之間時(shí)，馬鈴薯皮黃酮得率逐漸增加，當(dāng)達(dá)到20∶1時(shí)，得率最高為(6.17±0.17) mg/g，當(dāng)液固比大于20∶1時(shí)，黃酮得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由50%上升至70% 時(shí)，馬鈴薯皮黃酮隨之增加，在70%時(shí)達(dá)到最大值(5.97±0.11) mg/g，乙醇濃度繼續(xù)上升時(shí)，黃酮得率顯著下降。

圖1 五因素對(duì)馬鈴薯皮黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化馬鈴薯皮黃酮提取工藝

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定在微波功率700 W、提取時(shí)間25 min的條件下，分別以乙醇濃度(A)、液固比(B)、提取溫度(C)為考察因素，以黃酮得率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析

通過(guò)Design-Expert 8.05b響應(yīng)面分析軟件分析，方差如表2所示。得到馬鈴薯皮黃酮得率(Y)對(duì)自變量乙醇濃度(A)、液固比(B)、提取溫度(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=6.46-0.21A+0.25B-0.091C-0.32AB+0.099AC+0.17BC-1.06A2-0.89B2-0.77C2。F檢驗(yàn)顯示模型具有很高的F值和極低的P值(P<0.01)，說(shuō)明模型高度顯著。失擬項(xiàng)為0.081 6，沒有達(dá)到顯著水平，表明所建立的回歸模型可以用來(lái)分析該工藝條件。在一次項(xiàng)中的A、B以及二次項(xiàng)中的A2、B2、C2對(duì)黃酮得率的影響達(dá)到極顯著水平，C達(dá)到顯著水平，這表明這3個(gè)因素與黃酮得率有直接的關(guān)系，是影響得率的主要因子。

注：P<0.01，差異極顯著**；P<0.05，差異顯著*

圖2 各因素交互作用對(duì)馬鈴薯皮黃酮得率的影響

2.2.3 交互作用分析

響應(yīng)面圖形是控制其中一個(gè)因素在0水平，響應(yīng)值對(duì)應(yīng)其余2個(gè)因素所做的三維曲面圖和等高線圖，其可以直觀地反映出各因素及其兩兩之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[16-17]。由圖2a可以看出乙醇濃度和液固比具有明顯的交互作用，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，黃酮得率隨著液固比的增大而增大，達(dá)到最大值后變?yōu)橄陆担汗瘫葘?duì)響應(yīng)值的影響也與其相類似；圖2b顯示乙醇濃度與提取溫度之間具有明顯的交互作用，當(dāng)液固比一定時(shí)，黃銅得率隨著乙醇濃度的升高而升高，達(dá)到最大值后隨即降低，提取溫度對(duì)黃酮得率的影響也與之相類似；圖2c顯示液固比與提取溫度也具有明顯的交互作用，固定乙醇濃度不變，隨著液固比的增大，黃酮得率先升高后降低，提取溫度對(duì)黃酮得率的影響也呈現(xiàn)此規(guī)律。

2.2.4 最佳工藝條件確定與驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert 8.05b軟件分析，馬鈴薯皮黃酮類物質(zhì)提取的最佳條件是乙醇濃度68.78%，液固比20.81∶1，提取溫度70.34 ℃。在最佳提取條件下預(yù)測(cè)黃酮得率最大值為6.49 mg/g。綜合考慮實(shí)際，確定最后修正的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液固比20∶1、提取溫度70 ℃，在此條件下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示黃酮得率為(6.50±0.06) mg/g，與模型預(yù)期值差異不顯著。說(shuō)明該優(yōu)化結(jié)果可靠，可以用于指導(dǎo)馬鈴薯皮黃酮的提取工藝。

2.3 馬鈴薯皮黃酮的制備及純化

通過(guò)該最優(yōu)條件制備得到的馬鈴薯皮黃酮，其得率為(29.87±0.08)%，黃酮含量為(21.80±0.03) mg/g。根據(jù)1.7所述方法對(duì)馬鈴薯皮黃酮進(jìn)行純化，得到純化后的馬鈴薯皮黃酮純化物，其中黃酮含量達(dá)到(657.92±0.07) mg/g。

2.4 馬鈴薯皮黃酮抗氧化活性的研究

2.4.1 馬鈴薯皮黃酮對(duì)DPPH·的清除作用

馬鈴薯皮黃酮對(duì)DPPH·的清除能力結(jié)果如圖3所示。可以看出，隨著濃度的升高，其對(duì)DPPH·的清除能力也隨之增強(qiáng)。計(jì)算得到馬鈴薯皮黃酮對(duì)DPPH·清除率的IC50值為(1.02±0.07) mg/mL，與VC的IC50[(7.96±0.03) μg/mL]相比雖較大，但其仍然具有較好的DPPH·清除能力。同時(shí)發(fā)現(xiàn)其IC50與馬鈴薯皮黃酮純化物的IC50[(30.18±0.02) μg/mL]所成的倍數(shù)關(guān)系剛好與兩者黃酮含量所呈倍數(shù)相當(dāng)，說(shuō)明馬鈴薯皮中的黃酮類物質(zhì)是使馬鈴薯皮黃酮具有良好的清除DPPH·能力的主要物質(zhì)。

圖3 馬鈴薯皮黃酮對(duì)DPPH·的清除能力

2.4.2 馬鈴薯皮黃酮抗菜籽油抗氧化的作用

以VC為陽(yáng)性對(duì)照，研究24 h后不同濃度的馬鈴薯皮黃酮對(duì)菜籽油的抗氧化性，見圖4。當(dāng)質(zhì)量為油重的0.02%時(shí)，馬鈴薯皮黃酮緩解菜籽油過(guò)氧化值上升的效果已與相同濃度的VC作用相當(dāng)。當(dāng)質(zhì)量≥油重的0.04%時(shí)，其對(duì)菜籽油的抗氧化作用顯著、極顯著優(yōu)于VC。不同時(shí)間馬鈴薯皮黃酮、以及與其黃酮含量相當(dāng)?shù)鸟R鈴薯皮黃酮純化物對(duì)菜籽油過(guò)氧化值的影響見圖5。隨著時(shí)間的增加，加入馬鈴薯皮黃酮、馬鈴薯皮黃酮純化物的菜籽油過(guò)氧化值極顯著低于空白菜籽油，且兩者對(duì)菜籽油過(guò)氧化值的影響無(wú)顯著差異，說(shuō)明馬鈴薯皮中的黃酮類物質(zhì)是使馬鈴薯皮黃酮具有良好的抗菜籽油氧化能力的主要物質(zhì)。

圖4 馬鈴薯皮黃酮及VC對(duì)菜籽油過(guò)氧化值的影響

圖5 不同時(shí)間馬鈴薯皮黃酮對(duì)菜籽油過(guò)氧化值的影響

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)微波提取馬鈴薯皮黃酮工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到其最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液固比20∶1、提取溫度70 ℃、微波功率700 W、提取時(shí)間25 min，此時(shí)黃酮的得率為(6.50±0.06) mg/g。通過(guò)該最優(yōu)條件制備得到的馬鈴薯皮黃酮，其得率為(29.87±0.08)%，黃酮含量為(21.80±0.03)mg/g。使用AB-8大孔吸附樹脂對(duì)馬鈴薯皮黃酮進(jìn)行初步純化，使其黃酮含量升至(657.92±0.07) mg/g。

對(duì)馬鈴薯皮黃酮進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其具有較好的DPPH·清除能力，清除率的IC50為(1.02±0.07) mg/mL。同時(shí)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯皮黃酮具有良好的抗菜籽油氧化活性，當(dāng)質(zhì)量為油重的0.02%時(shí)，馬鈴薯皮黃酮緩解菜籽油過(guò)氧化值上升的效果與相同濃度的VC作用相當(dāng)。當(dāng)質(zhì)量≥油重的0.04%時(shí)，馬鈴薯皮黃酮對(duì)菜籽油的抗氧化作用顯著優(yōu)于VC。綜上所述，馬鈴薯皮黃酮具有較好的抗氧化活性，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，馬鈴薯皮中的黃酮類物質(zhì)是使其具有抗氧化活性的主要功效物質(zhì)。

綜合分析，馬鈴薯皮中富含黃酮類物質(zhì)，且其黃酮提取物具有較好的DPPH·清除能力和抗菜籽油氧化能力，可進(jìn)一步研制成天然抗氧化劑，用于防止或延緩食品的氧化。