支鏈淀粉結(jié)構(gòu)對(duì)稻米淀粉糊化特性的影響

周慧穎 彭小松 歐陽林娟 朱昌蘭 陳小榮 傅軍如 邊建民 胡麗芳 賀浩華 賀曉鵬

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院;作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 雙季稻現(xiàn)代化生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南昌 330045)

直鏈淀粉含量(Amylose Content,AC)對(duì)稻米食味品質(zhì)有重要影響[1-2]，而支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的不同是導(dǎo)致AC相似品種間品質(zhì)差異的重要因素[3-4]。支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)包括鏈長和鏈長分布、平均鏈長(Average Chain Length,CL)、平均外鏈長(Average exterior Chain length,ECL)、平均內(nèi)鏈長(Average Internal Chain Length,ICL)、A∶B值等參數(shù)[5]。在支鏈淀粉鏈長和鏈長分布與稻米品質(zhì)和淀粉理化特性關(guān)系的研究方面，胡志萍等[6]研究表明，淀粉的鏈長及支鏈淀粉長、中、短鏈的比例不同，可以使相同AC的品種可能具有不同的糊化溫度和膠稠度。賀曉鵬等[7]研究指出，支鏈淀粉不同鏈長范圍的支鏈數(shù)量比例主要與淀粉的糊化溫度相關(guān)，而與淀粉的膠稠度和RVA成糊特性關(guān)系不密切。還有報(bào)道，Vandeputte等[8]認(rèn)為支鏈淀粉DP為6～9的短鏈引起糊化溫度下降；DP為12～22的鏈?zhǔn)沟闷鹗己瘻囟?Onset Gelatinization Temperature,To)上升；DP值為6～9和DP>25的支鏈淀粉鏈降低了支鏈淀粉終結(jié)糊化溫度(End Gelatinization temperature,Te)及糊化焓(Gelatinization Enthalpy,ΔH)。除鏈長和鏈長分布外，稻米支鏈淀粉的CL、ECL、ICL、A∶B值等結(jié)構(gòu)參數(shù)的研究相對(duì)較少。

本研究選取了26個(gè)AC為11%～15%的低AC類型水稻品種，應(yīng)用改進(jìn)的酶法測定了支鏈淀粉的β-淀粉酶水解率、CL、ECL、ICL、A∶B值等結(jié)構(gòu)參數(shù)，探討了支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)與稻米淀粉RVA成糊特性及DSC熱特性的相關(guān)性，以明確支鏈淀粉結(jié)構(gòu)對(duì)稻米品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選取26個(gè)AC為11%～15%的低AC類型水稻品種，其中秈稻品種8個(gè)，粳稻品種18個(gè)，具體見表1。各供試品種于2014年在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)田作中稻種植，均按常規(guī)水肥管理，分期播種，同期收獲。水稻種子成熟后收獲曬干，用精米機(jī)充分研磨成精米后進(jìn)一步磨成米粉，通過100目的篩子，充分干燥后密封保存，用于后續(xù)研究。

β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)、異淀粉酶(EC 3.2.1.68)：Sigma-Aldrich公司。

SCINO-CT410旋風(fēng)式樣品磨：瑞典FOSS公司；TU-1810D紫外可見分光光度計(jì)：北京普析公司；RVA-TecMaster黏度速測儀：瑞典Perten公司；DSC4000差示掃描量熱儀：美國Perkin-Elmer公司。

1.2 支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的測定

利用基于β-淀粉酶、異淀粉酶、普魯蘭酶的酶法并加以優(yōu)化后進(jìn)行支鏈淀粉CL、ECL、ICL、A∶B值的測定[9]。

1.2.1 支鏈淀粉的分離與純化

支鏈淀粉的純化參照賀曉鵬等[7]的方法。

1.2.2 β-淀粉酶水解率的測定

稱取0.5 g純支鏈淀粉放入50 mL的離心管中，加入濃度為0.02 mol/L，pH 5.0的醋酸緩沖液25 mL，充分混勻后加入β-淀粉酶2 500 U，同時(shí)滴加1～2滴甲苯防止微生物生長，然后37 ℃水浴保溫反應(yīng)時(shí)間48 h后，將反應(yīng)液置于沸水浴中25 min滅酶，冷卻后測定體系中的總糖和總還原力，以不加酶的樣品作為對(duì)照，計(jì)算支鏈淀粉β-淀粉酶水解率：

β-淀粉酶水解率=還原力(麥芽糖當(dāng)量)×100/總糖(麥芽糖當(dāng)量)

1.2.3 支鏈淀粉鏈長的測定

稱取22 mg純支鏈淀粉放入5 mL離心管中，加入濃度為0.05 mol/L，pH 5.0的醋酸緩沖液5 mL，充分混勻后加入普魯蘭酶4 U，液面以1～2滴甲苯覆蓋后置于37 ℃的水浴中保溫。反應(yīng)24 h后，將反應(yīng)液沸水浴滅酶20 min，冷卻后利用蒽酮-硫酸法和二硝基水楊酸(DNS)法測定體系中的總糖和還原糖含量(μg/mL)，以不加酶的樣品作為對(duì)照計(jì)算CL，并計(jì)算出ECL和ICL：

CL=產(chǎn)物中的總糖(葡萄糖當(dāng)量)/產(chǎn)物中的總還原力(葡萄糖當(dāng)量)

ECL=CL ×β-淀粉酶水解率+2.0

ICL=(CL-ECL)-1.0

1.2.4 支鏈淀粉A∶B值的測定

將測定β-淀粉水解率時(shí)的最終反應(yīng)液加入3倍體積甲醇，冰浴30 min后6 000 r/min離心5 min，傾去上清液，加入75%的甲醇沖洗沉淀，37 ℃恒溫干燥后用研缽磨成細(xì)粉，即得支鏈淀粉β-極限糊精。稱取5 mg支鏈淀粉β-極限糊精于2 mL離心管中，加入200 μL蒸餾水，沸水浴中加熱攪拌10 min。再次加入濃度為0.04 mol/mL，pH4.5的醋酸緩沖液，沸水浴中加熱攪拌10 min后冷卻至室溫，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的β-極限糊精溶液。以此為底物，取2 mL加入異淀粉酶100 U/mL，在37 ℃條件下振蕩反應(yīng)24 h后，置沸水浴中加熱20 min滅活異淀粉酶，利用DNS法測定其還原糖含量C1(μg/mL)。繼續(xù)往反應(yīng)液中加入普魯蘭酶1 U/mL，在37 ℃條件下振蕩反應(yīng)24 h后，置沸水浴中加熱20 min滅活普魯蘭酶，測定其還原糖含量C2(μg/mL)，即可計(jì)算出A∶B值：

C1=B+0.5A

C2=B+A

1.3 稻米R(shí)VA成糊特性的測定

RVA成糊特性采用黏度速測儀測定，按AACC(美國谷物化學(xué)家協(xié)會(huì))操作規(guī)程，并用TCW配套軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[10]。稱取實(shí)驗(yàn)樣品3.0 g放入鋁罐內(nèi)，加入25 mL蒸餾水，充分混勻后，放入儀器中進(jìn)行糊化。具體測定過程如下：先在50 ℃下保持1 min，然后在3.75 min內(nèi)恒速升溫至95 ℃，并保持2.5 min，再以恒速在3.75 min內(nèi)降溫到50 ℃，并且保持1.4 min。攪拌器在起始10 s內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)速度為960 r/min，之后保持在160 r/min，從測定開始到結(jié)束共需12.5 min。RVA成糊特性曲線用最高黏度(PKV)、熱漿黏度(HPV)、冷膠黏度(CPV)、崩解值(BDV,PKV-HPV)、消減值(SBV,CPV-PKV)等特征值來表示，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

1.4 DSC熱特性的測定

DSC熱特性用差示掃描量熱儀測定。稱取5.0 mg左右實(shí)驗(yàn)樣品置于鋁盒中，并記錄其具體重量，然后加入15 μL的蒸餾水，用配套鋁蓋密封鋁盤，在室溫下平衡過夜。以只加蒸餾水的鋁盤作為參比，測定處理樣品，以10 ℃/min的升溫速率從30 ℃上升到110 ℃，得到試樣的DSC熱特性曲線。To、最高糊化溫度(Peak gelatinization temperature,Tp)、Te及糊化時(shí)的ΔH等參數(shù)在配套通用分析軟件中分析得到[11]，每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[12]，對(duì)全部品種和AC為11%～13%及AC為13%～15%兩組的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)與RVA成糊特性及DSC熱特性的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水稻品種支鏈淀粉結(jié)構(gòu)和淀粉糊化特性

26個(gè)參試品種的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)參數(shù)和RVA成糊特性及DSC熱特性參數(shù)的測定結(jié)果見表1和表2。進(jìn)一步分析參試水稻品種的支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)參數(shù)之間的相關(guān)性(表3)發(fā)現(xiàn)，在支鏈淀粉結(jié)構(gòu)參數(shù)之間除了ICL與CL、A∶B值間無顯著的相關(guān)性間，其他參數(shù)兩兩之間均檢測到了顯著的相關(guān)性，可見支鏈淀粉不同結(jié)構(gòu)參數(shù)之間相互都有關(guān)聯(lián)。

表1 26份低AC水稻品種AC及其結(jié)構(gòu)參數(shù)

表3 支鏈淀粉結(jié)構(gòu)間的相關(guān)性

注：*、 ** 分別為達(dá)顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)，下同。

2.2 支鏈淀粉結(jié)構(gòu)與淀粉糊化特性參數(shù)的相關(guān)性

支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)和淀粉RVA成糊特性及DSC熱特性間的相關(guān)性見表4，由表4可知，26個(gè)水稻品種中ECL與DSC熱特性中的To、Tp呈極顯著正相關(guān)，與Te也呈顯著正相關(guān)；與RVA成糊特性中的PKV呈極顯著負(fù)相關(guān)，與SBV呈極顯著正相關(guān)，與HPV、BDV呈顯著負(fù)相關(guān)。CL與To、Tp、Te呈顯著正相關(guān)；與PKV、BDV呈極顯著負(fù)相關(guān)，與SBV呈極顯著正相關(guān)。A∶B值與To呈顯著負(fù)相關(guān)，與PKV、BDV呈顯著正相關(guān)，與SBV呈顯著負(fù)相關(guān)。ICL只與To呈顯著負(fù)相關(guān)，與其他參數(shù)間的相關(guān)性不明顯。為盡量排除AC對(duì)稻米淀粉糊化特性的影響，將參試的26個(gè)品種按AC分成11%～13%(12個(gè)品種)和13%～15%(14個(gè)品種)兩組，由表4可知，兩組材料的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)與淀粉RVA成糊特性及DSC熱特性的相關(guān)性與全部26個(gè)品種間的基本一致。具體表現(xiàn)為，ECL在兩組材料中與To、Tp呈顯著正相關(guān)；與PKV呈顯著負(fù)相關(guān)，與SBV呈顯著正相關(guān)。CL在兩組材料中與Tp呈顯著正相關(guān)；與PKV、BDV在11%～13%分組和13%～15%分組間分別呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)；與SBV在11%～13%分組和13%～15%分組間分別呈極顯著和顯著正相關(guān)。A∶B值與To呈顯著負(fù)相關(guān)，與PKV、BDV呈顯著正相關(guān)，與SBV呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

支鏈淀粉作為稻米淀粉的最主要組分，是淀粉粒各級(jí)結(jié)構(gòu)形成和稻米理化特性的主要決定因素，也是造成AC相同或相近的水稻品種間稻米品質(zhì)差異的主要原因。現(xiàn)有研究表明，稻米淀粉的糊化過程，實(shí)質(zhì)上就是淀粉晶體的溶解，其中涉及了淀粉體形狀的差異、淀粉體間排列的緊密程度、直鏈淀粉從淀粉體中的浸出、支鏈淀粉鏈的分子組成、淀粉晶體中支鏈淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)的斷裂和分解等[13]。在本研究中，26個(gè)水稻品種的CL、ECL與To、Tp、Te呈正相關(guān)，A∶B值與To呈負(fù)相關(guān)，這可能是由于稻米支鏈淀粉的短鏈比例高時(shí)，由于短鏈不能最大程度地堆積到晶體片層中去，晶體化順序較差，因而To、Tp、Te低；而當(dāng)支鏈淀粉中的長鏈比例高時(shí)，這些長鏈可能通過形成較長的雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致糊化時(shí)需要較高的溫度來解離，因而To、Tp、Te高[14-15]。同時(shí)，相對(duì)較高To、Tp、Te的稻米品種具有相對(duì)緊密的組織結(jié)構(gòu)，在淀粉糊化時(shí)水分滲透、擴(kuò)散到淀粉顆粒內(nèi)部的能力和速度較慢，因此支鏈淀粉的長鏈所占比率越高的稻米品種在蒸煮時(shí)需要更多的水分和更長的蒸煮時(shí)間[16-17]。

近年來，RVA成糊特性與稻米品質(zhì)的關(guān)系已有了一定的研究[18-21]，在本研究中，26個(gè)水稻品種的CL、ECL與PKV和BDV呈負(fù)相關(guān)，A∶B值與PKV和BDV呈正相關(guān)，這可能是由于支鏈淀粉中長鏈的比率越高，分子間的作用力就越強(qiáng)，抑制了淀粉的膨脹，蒸煮性變差，不利于淀粉的糊化，PKV降低；同時(shí)長鏈也使糊化過程中支鏈淀粉結(jié)構(gòu)不易破裂，使淀粉顆粒結(jié)構(gòu)維持在膠稠化狀態(tài)，抑制了淀粉糊液黏度的下降，從而降低了BDV，米飯質(zhì)地變硬，食味品質(zhì)下降[22-23]。研究還發(fā)現(xiàn)，CL、ECL與SBV呈正相關(guān)，而A∶B值與其呈負(fù)相關(guān)，這是由于淀粉糊化過程后期，隨著溫度的降低，米糊中的直鏈淀粉和支鏈淀粉再度進(jìn)行分子間的重排，因此，支鏈淀粉中長含量越高，淀粉中的分子重新排列越容易形成恢復(fù)成有序狀態(tài)，SBV增大；而支鏈淀粉中短鏈含量越高，其分子鏈間的松散程度越高，從而減弱了淀粉分子鏈重新締合的緊密程度，SBV減小，米飯冷卻后表現(xiàn)出良好的抗回生能力。

表4 支鏈淀粉結(jié)構(gòu)與淀粉糊化及熱特性參數(shù)間的相關(guān)性

4 結(jié)論

支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的不同是導(dǎo)致AC相近的水稻品種間品質(zhì)差異的主要原因，淀粉的鏈長結(jié)構(gòu)是影響淀粉糊化的主要因素，支鏈淀粉的CL、ECL、A∶B值對(duì)淀粉RVA成糊特性及DSC熱特性有較大影響。26個(gè)水稻品種的CL、ECL與To、Tp、Te、SBV呈正相關(guān)，與PKV和BDV呈負(fù)相關(guān)；A∶B值與PKV和BDV呈正相關(guān)，與To、SBV呈負(fù)相關(guān)，因此，低CL、ECL及高A∶B值的稻米淀粉RVA成糊特性較好、糊化溫度較低。