一株DMP降解菌的分離鑒定及特性研究

徐偉慧，劉 帥，王志剛，2*

（1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農業部華南都市農業重點實驗室，廣州510640）

鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid ester，PAEs）又被稱作酞酸酯，是一種使用面廣，年產量大的人工合成有機化合物[1]。其常被用作增塑劑和軟化劑而添加到塑料用品之中，PAEs被證明具“三致”作用[2-3]。目前PAEs已廣泛存在于空氣、水體和土壤等環境介質，并在動植物體內積累[4-5]，最終通過食物鏈危害人類的健康。

PAEs在環境中尤其是土壤環境中不易自然降解，因此利用微生物降解土壤環境中的PAEs已經成為研究熱點。中國國家環境監測中心將鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）和鄰苯二甲酸二辛酯（DNOP）3種PAEs確定為環境優先控制污染物[6-7]。本實驗室前期研究發現DMP可改變黑土土壤呼吸，影響土壤酶活性以及物質的代謝，使黑土微生物區系結構和功能代謝菌群數量發生改變，微生物多樣性降低[8-9]，導致黑土生態系統功能受到影響。因此，尋找高效的DMP降解菌尤為重要。本研究以長期覆蓋塑料廢棄物的垃圾場的土壤為試材，篩選能降解DMP的菌株并研究其特性，旨在分離降解DMP的優勢菌種，為今后構建具有高效降解性能的微生物體系及控制DMP污染和土壤生物修復的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試培養基

微量元素儲備液：CaSO4·5H2O 4.0 g，FeSO4·7H2O 7.0 g，FeCl3·6H2O 7.0 g，CoCl3·6H2O 0.2 g，NaMO4·2H2O 3.4 g，CaCl22.0 g，H2O 1000 mL，pH 7.0。

基礎無機鹽（MSM）培養基：K2HPO4·12H2O 1.0 g，KH2PO41.0 g，NH4Cl 0.8 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，微量元素儲備液2 mL，H2O 1000 mL。

LB 培養基：蛋白胨 10.0 g，酵母粉 5.0 g，NaCl 10.0 g，H2O 1000 mL。

1.2 DMP降解菌的分離與鑒定

從長期覆蓋塑料廢棄物的露天垃圾場中采集土樣，稱5 g土樣放于含有50 mg·L-1DMP的MSM培養液中進行梯度壓力馴化培養，在溫度30℃，轉速130 r·min-1的條件下培養3 d，取1 mL菌液接種到含有100 mg·L-1DMP的MSM培養基中繼續培養，3 d后從含有100 mg·L-1DMP的MSM培養基中取1 mL菌液接種到含有150 mg·L-1DMP的MSM培養基中繼續培養，以此步驟進行培養，30 d后直至培養基中的DMP濃度達到500 mg·L-1，培養30 d后，取0.1 mL菌液稀釋涂布到固體MSM培養基平板中，30℃培養7 d。挑選不同菌落形態的單菌落接種到新鮮的MSM瓊脂板上進行劃線培養。隨后重復劃線培養2～3次，在此期間用接種環挑取細菌進行番紅染色，并利用光學顯微鏡制片觀察，直至分離的培養物為純培養物的單菌落，將分離純化得到的細菌接入LB液體培養基中進行培養，3 d后取菌液離心，棄上清，沉淀保存在-20℃的冰箱中備用。

16S rDNA序列分析：使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（編號：B518255）提取DNA。PCR擴增 采 用 細 菌 通 用 引 物[10]，27f：（5′-AGAGTTT?GATCCT-GGCTCAG-3′）和 1492r：（5′-TACG?GCTACCTTGTTACG-ACTT-3′），由上海生工合成。PCR反應體系20 μL為：10×Ex Taq buffer 2.0 μL、2.5 Mm dNTP Mix 1.6 μL、5p 27f 0.8 μL、5p 1492r 0.8 μL、DNA 模板 0.5 μL、5u Ex Taq 0.2 μL、ddH2O 14.1 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，24個循環，72℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒純化PCR產物，送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。測序結果在NCBI的GenBank數據庫中進行Blast比對，尋找與目的序列同源性最高的已知分類地位菌種的16S rDNA序列。采用MEGA 5.0軟件以鄰接法構建系統發育樹。

1.3 DMP降解菌生長及降解的特性研究

將純菌株接種到150 mL含有500 mg·L-1DMP的MSM培養基中，在轉速130 r·min-1、溫度30℃的條件下培養3 d，每隔12 h測量菌液OD600，并取10 mL菌液離心，取上清用乙酸乙酯萃取，將上層有機相旋轉蒸發，利用高效液相色譜測量培養基中剩余的DMP濃度。所有的實驗均重復3次。

1.4 DMP降解菌對不同碳源的利用

將0.1 mL菌液分別接種到含有不同碳源為底物的MSM培養基中，在轉速130 r·min-1，溫度30℃的條件下培養3 d。根據菌株的生長情況以及OD600的大小確定降解菌對不同碳源的利用能力。底物分別為DMP、DBP（鄰苯二甲酸二丁酯）、DEP、DEHP（鄰苯二甲酸二異辛酯）、PA（鄰苯二甲酸）、PCA（原兒茶酸）、蔗糖和葡萄糖。

1.5 不同溫度和pH對DMP降解菌生長的影響

將菌株接種在MSM的液體培養基中（DMP 500 mg·L-1），30 ℃、130 r·min-1條件下活化培養36 h。取1 mL活化后的菌液接種到含有不同pH的MSM培養基的三角瓶內，pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，以30 ℃、130 r·min-1條件培養3 d。每隔12 h取5 mL菌液測量OD600，所有實驗均重復3次。

將1 mL活化后的菌液接種到含有500 mg·L-1DMP的 MSM 培養基（pH7）中，分別在 25、27.5、30、32.5℃和35℃溫度下培養3 d。每隔12 h取5 mL菌液測量OD600，所有實驗均重復3次。

1.6 DMP降解菌降解DMP的動力學方程及中間代謝產物研究

取1 mL活化后的菌液接種到含有不同初始DMP（100、200、300、400 mg·L-1和500 mg·L-1）濃度的MSM培養基中，在轉速130 r·min-1及最佳pH和溫度的條件下培養3 d（pH 8，30℃）。每隔12 h取10 mL培養液4000 r·min-1離心10 min，上清液用乙酸乙酯萃取，旋轉蒸發儀濃縮，高效液相色譜分析儀測量培養基中剩余的DMP濃度。利用液相質譜聯用技術分析降解過程中所生成的中間代謝產物。動力學參數的計算參考Chen等[11]的方法，曲線擬合動力學分析采用Sig?ma Plot軟件，所有的測試均重復3次。

1.7 DMP降解菌降解基因的擴增

使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（編號：B518255）從新培養的菌液中提取細菌DNA。根據Eaton[12]發現的降解基因序列設計引物，引物如表1所示。以降解菌DNA為模板分別在不同退火溫度下進行PCR擴增，跑瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察，切取符合目的片段大小的PCR產物送至上海生工測序，核酸序列在NCBI網站進行比對。

1.8 數據處理方法

采用Excel 2013和Sigma Plot等軟件進行數據統計分析與作圖。

2 結果與分析

2.1 DMP降解菌的分離與鑒定

本研究通過馴化、富集培養4周后成功從長期覆蓋塑料廢棄物的垃圾場土壤中分離了一株DMP降解菌，將其命名為QD15-1，菌株QD15-1是一株好氧菌，在DMP為唯一碳源和能源的MSM平板上菌落形態呈現出不透明的乳黃色，菌落表面濕潤，邊緣整齊如圖1a。

在光學顯微鏡下菌體為球狀，無芽孢，革蘭氏染色為陰性（圖1b）。生理生化指標見表2，伏-普試驗、油脂水解試驗和吲哚試驗等結果為陽性，其余試驗為陰性。

圖1 菌株QD15-1的菌落圖與顯微觀察Figure 1 Colony of strain QD15-1 and microscopic observation

表2 菌株QD15-1的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain QD15-1

表1 用于PCR分析的基因和引物Table 1 Genes and primers used in PCR analysis

根據16S rDNA的測序結果和GenBank中已登錄的核苷酸序列進行同源性比較，發現菌株QD15-1與Paracoccus sp.CY-b28（JX997853.1）等的同源相似度為100%，并采用MEGA 5.0軟件構建菌株QD15-1的16S rDNA系統發育樹（圖2），基于菌株的形態學特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析，將菌株確定為Paracoccus sp.QD15-1。

2.2 DMP降解菌的生長曲線及其對DMP的降解效應

菌株Paracoccus sp.QD15-1的生長曲線及其對DMP的降解情況如圖3所示。隨著菌株QD15-1吸光值（OD600）逐漸增高，培養基中的DMP含量下降。菌株QD15-1接種到培養基中12 h內菌液的吸光值增長很小，表明菌株QD15-1繁殖量少，此階段為菌株的適應期，此時期內DMP降解速率小。12～48 h是菌株QD15-1的對數生長期，此時期菌株QD15-1生長迅速，菌液OD600增長迅速，培養基中DMP的濃度下降最為明顯，且下降到最低值。48～60 h，菌株QD15-1生長進入到穩定期，此時期內菌液的吸光值達到最高，OD600為1.64，并保持穩定，表明培養基的菌體量已達到最大，此時培養基中DMP濃度略有上升。經過60 h的培養，培養基中DMP濃度從500 mg·L-1下降到50.16 mg·L-1，降解率為89.9%。

2.3 降解菌株QD15-1對不同碳源底物的利用

培養3 d后通過吸光值大小判斷菌株利用底物的能力，菌株QD15-1利用不同底物的情況如表3所示。菌株QD15-1能利用DMP、DBP、DEP、DEHP、PA和葡萄糖為唯一碳源和能源在MSM培養基中生長，但其不能利用PCA和蔗糖進行生長。

2.4 不同pH對菌株QD15-1生長的影響

不同pH對菌株QD15-1生長的影響如圖4所示。從圖4中可以看出，菌株QD15-1能夠在pH 6～9范圍內生長，在pH 5條件下，菌株QD15-1不能正常生長；在pH 7和pH 8條件下，菌株QD15-1進入對數生長期的時間要早于pH 9，且在pH 7和pH 8條件下，菌株QD15-1對數生長期的增長率十分接近，在pH 8的條件下菌液OD600最大，因此，以DMP為唯一碳源，菌株QD15-1生長最適pH為8。

表3 菌株QD15-1利用底物的試驗Table 3 The test of strains QD15-1 using the substrate

圖2 基于QD15-1和相關菌株的16S rDNA序列采用鄰接法建立的系統發育樹Figure 2 Established phylogenetic tree by neighbor-joining method，based on 16S rDNA sequences of QD15-1 and the related strains

圖4 不同pH對菌株QD15-1生長的影響Figure 4 The effect of different pH on strain QD15-1 growth

2.5 不同溫度對菌株QD15-1生長的影響

從圖5中可以看出，菌株QD15-1能夠在25～35℃這個范圍內生長，培養12 h后菌株進入對數生長期，在25℃下菌株進入對數生長期的OD600最低，35℃條件下菌株生長速率先慢后快，30℃條件下菌株進入對數生長期的OD600最高，表明在30℃時菌株QD15-1的生長速度最快。因此，以DMP為唯一碳源，菌株QD15-1最適生長溫度為30℃。

2.6 菌株QD15-1降解DMP的動力學方程

如圖6所示，培養60 h后菌株QD15-1可降解大部分DMP，降解率隨著初始DMP濃度的升高（100、200、300、400、500 mg·L-1）而增高，分別為 80.0%、89.0%、89.6%、91.7%和97.0%。同時菌株QD15-1降解DMP符合一級動力學方程：

式中：C為DMP隨著時間增長的剩余濃度，t為培養時間，K為一級動力學常數，A表示常數。DMP生物降解的半衰期可以根據下面方程計算：

圖5 不同溫度對菌株QD15-1生長的影響Figure 5 The effect of different temperature on growth of strain QD15-1

圖6 不同初始DMP濃度對菌株QD15-1降解能力的影響Figure 6 The effect of different initial concentrations of DMP ondegradation ability of strain QD15-1

表4顯示降解菌QD15-1在不同初始DMP濃度（100～500 mg·L-1）下的降解動力學方程。DMP生物降解過程符合一級降解動力學方程（R2＞0.9）。隨著DMP濃度的增加，其半衰期相應地縮短，從2.17 d縮短到0.84 d。

2.7 降解基因的確認

從QD15-1的基因組中擴增出2個降解基因，測序結果顯示，一個基因的長度為577 bp，此基因序列與Arthrobacter keyseri 12B中發現的鄰苯二甲酸酯雙加氧酶基因小亞基的同源相似度高達92%，該基因在Genbank的名稱及登錄號為：PAphtAb（MH040800）。另一個基因的基因長度為1008 bp，此基因序列與Ar?throbacter keyseri 12B中發現的3，4-二羥基-3，4二氫鄰苯二甲酸脫氫酶的同源相似度為88%，該基因在Genbank的名稱及登錄號為：PAphtB（MH040801）。

2.8 中間代謝產物的確認及代謝途徑的推測

從圖7a中可看出，DMP的峰值在色譜圖中保留的時間為3.50 min，在光譜上其離子特征峰為163。圖7 b中顯示PA的峰值在色譜圖中保留的時間為0.81 min，在光譜上其離子特征峰為149。圖7c顯示PCA的峰值在色譜圖上保留的時間為1.26 min，其在光譜上離子特征峰為109和153。從圖8中可以看出，接入降解菌QD15-1培養3 d后，在色譜圖中有1個峰明顯升高，保留時間為1.62 min，其離子特征峰為149和163，由此可知，DMP可能生成了鄰苯二甲酸單酯；而未接入降解菌株QD15-1的在1.62 min處也有一個微小的峰，表明DMP可在常溫條件下水解形成鄰苯二甲酸單酯，但降解速度很慢。同時，在圖8b中還出現了2個新的峰，保留時間分別為0.63 min和5.0 min，其中保留時間為0.63 min，峰的光譜特征很亂，暫時不能確定其是什么物質，而保留時間為5.0 min，峰的光譜特征峰為149，與PA的特征峰吻合，說明培養基中有PA生成。因此，聯系之前降解基因擴增的結果，可推測DMP在降解菌的作用下首先水解生成鄰苯二甲酸單酯，然后再轉化成PA，在鄰苯二甲酸雙加氧酶基因（PAphtAb）和3，4-二羥基-3，4-二氫鄰苯二甲酸脫氫酶基因（PAphtB）的作用下進一步降解。

表4 菌株QD15-1對不同初始濃度DMP生物降解的動力學方程Table 4 DMP degradation kinetics equation in different initial concentration by strain QD15-1

圖7 標準物DMP（a）、PA（b）和PCA（c）的色譜圖和光譜圖Figure 7 Standard DMP（a），PA（b）and PCA（c）chromatograms and spectra

3 討論

圖8 未接入降解菌QD15-1（a）和接入降解菌QD15-1（b）培養3 d后的色譜圖Figure 8 The chromatograms of 3 days non-inoculation strain（a）and after inoculation degrading strain QD15-1（b）

本研究成功分離了一株能利用DMP作為唯一碳源生長的菌株，經鑒定為Paracoccus sp.QD15-1，好氧，革蘭氏陰性。近年來，關于Paracoccus sp.降解污染物的研究報道很多，如噬氨副球菌HPD-2能夠明顯提高土壤中多環芳烴的降解率[13]。張永樂等[14]分離了一株用于溴苯腈降解的副球菌MXX-04，能夠以溴苯腈為唯一氮源進行生長，降解率為95.3%。本研究中菌株Paracoccus sp.QD15-1能將培養基中濃度為 500 mg·kg-1的 DMP降解到50.16 mg·kg-1，降解率為89.9%。底物廣譜性利用實驗表明，該菌株能利用DMP、DBP、DEP和DEHP等，與陳湖星等[15]研究結果類似，其篩選出的不動桿菌HS-B1能分別以BBP、DMP、DEP、DBP、DEHP 等 PAEs類化合物為唯一碳源在MSM培養基中生長。Zhang等[16]從河底泥中篩選出能以PAEs為唯一碳源生長的菌株Sphingomonas sp.XJ1。金雷等[17]在長期受垃圾污染的土壤中篩選到一株DBP降解菌，該菌株在含有初始濃度為100 mg·L-1的DBP培養基中生長5 d可降解大部分DBP，降解率可達到82.7%。Wu等[18]分離鑒定的DBP降解菌可降解DBP最大為濃度400 mg·L-1，在48 h內降解率達96%，但沒有報道該菌株降解其他PAEs的能力。本研究篩選的菌株Paracoccus sp.QD15-1是一株高效降解DMP的菌株，隨著初始DMP濃度（100、200、300、400、500 mg·L-1）的升高，降解率升高，降解率分別為80.0%、89.0%、89.6%、91.7%和97.0%，可能原因是隨著碳源的增多，菌株生長繁殖較快，導致降解率提高。

菌株Paracoccus sp.QD15-1生長的pH范圍是6～9，溫度范圍是25～35℃，最適宜生長條件為初始pH 8.0，溫度30℃。該菌株與已發現的PAEs降解菌Pae?nibacillus sp.S-3[19]相比，能更好地適應堿性環境，在修復堿性環境中DMP污染時具有優勢。同時，本研究發現隨著DMP的降解，搖瓶內pH會發生變化，培養3 d后，初始pH值為5到9的搖瓶內pH會降低，可能原因是底物DMP在菌株的作用下被快速降解生成鄰苯二甲酸，之后鄰苯二甲酸的生成量不再增加，pH也隨之穩定。而初始pH為5的搖瓶pH有所下降，但變化不大，可能與菌株不能在酸性條件下生長，鄰苯二甲酸生成量小有關。李魁曉等[20]研究DMP生物降解的過程中也發現了類似的現象。

菌株Paracoccus sp.QD15-1降解DMP符合一級降解動力學方程，Chen等[11]分離鑒定的DBP降解菌Camelimonas sp.M11同樣符合一級降解動力學方程。Zhao等[21]研究發現DBP降解菌Providencia sp.2D降解DBP的過程也符合一級動力學方程，不同的是該菌株降解DBP的半衰期隨著初始DBP濃度的升高而增長，初始濃度從50 mg·kg-1到1000 mg·kg-1，其半衰期從8.66 h增長到了26.16 h。本研究中菌株Paracoc?cus sp.QD15-1降解DMP半衰期的數值隨著DMP濃度的增加而縮短，從2.17 d縮短到0.84 d，可能與初始DMP濃度的升高降解率升高有關，說明高濃度的DMP對菌株Paracoccus sp.QD15-1的降解無抑制作用。

據文獻報道[22-24]，目前研究比較成熟的有兩種降解途徑，分別是細菌（G+）降解途徑和細菌（G-）降解途徑，這兩種途徑的第一步降解大致相同，都是通過PAEs的自然水解或者在酯酶的作用下進行水解形成鄰苯二甲酸，再經過雙加氧酶等一系列的酶作用生成原兒茶酚，再經一些酶的作用將苯環打開，最后逐步降解，最終生成水和二氧化碳。這兩種途徑不同的是涉及到的降解基因不同，其中革蘭氏陽性菌的降解基因是3，4雙加氧酶基因（phtA）和3，4-二羥基-3，4-二氫鄰苯二甲酸脫氫酶（phtB），而革蘭氏陰性菌通過鄰苯二甲酸4，5雙加氧酶（ophA）和4，5-二羥基-4，5-二氫鄰苯二甲酸脫氫酶（ophB）[25-26]。為了研究Para?coccus sp.QD 15-1降解DMP的途徑，本研究從基因和中間代謝產物兩方面對該菌株進行了研究。因菌株Paracoccus sp.QD 15-1為革蘭氏陰性菌，實驗首先選擇革蘭氏陰性菌降解途徑中所參與的基因設計引物進行PCR，遺憾的是經過反復多次PCR都得不到目的基因條帶，隨后本實驗又根據革蘭氏陽性菌降解途徑中所參與的基因設計了引物并進行PCR，有趣的是，PCR實驗成功得到了2條和目的基因大小相同的條帶，后經過純化、測序分析和BLAST比對，顯示這兩個條帶為實驗想要得到目的基因——鄰苯二甲酸酯雙加氧酶基因小亞基（PAphtAb）和3，4-二羥基-3，4-二氫鄰苯二甲酸脫氫酶（PAphtB），這兩個基因與Arthrobacterkeyseri 12B[12]上的降解基因的同源性分別為92%和88%。為什么革蘭氏陰性菌中會有革蘭氏陽性菌的基因，經過分析，推斷可能是基因片段和質粒在微生物之間發生了水平轉移。水平轉移是指某些基因如本實驗的降解基因通過轉化、轉導、接合等途徑在細菌和細菌之間、環境和細菌之間、病毒和細菌之間傳播，最終使得更多細菌獲得降解功能[27]。基因的水平轉移和基因的傳播突破了生物遺傳的種屬保守限制，基因可在同種屬細菌之間轉移，也可以在親緣關系較遠的細菌如革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌之間傳播[28]。因此，本研究分離得到DMP降解菌Paracoccus sp.QD 15-1為革蘭氏陰性，可能通過基因的水平轉移得到了革蘭氏陽性菌的基因片段并整合到了自己的基因組中，從而使自己獲得了降解PAEs的能力。

利用高效液相質譜對降解菌Paracoccus sp.QD 15-1的中間代謝產物進行研究，結果表明，在培養3 d后搖瓶中出現了新物質，分別為鄰苯二甲酸單酯和鄰苯二甲酸，表明DMP在降解菌的作用下首先水解生成鄰苯二甲酸單酯，然后再轉化成鄰苯二甲酸，這與Eaton[12]的研究發現PAEs在酯酶的作用下直接生成鄰苯二甲酸的結果有所不同，推斷可能是該菌株的基因組中沒有能夠讓PAEs快速水解的酯酶，而且這與PCR的結果也相互對應。另外，本研究發現Paracoc?cus sp.QD 15-1的降解中間產物中沒有原兒茶酸生成，這個結果恰好與降解基因的研究結果相一致，由于該菌株的降解基因中正好缺少了一個脫羧酶（phtC），所以導致PAEs只能降解到鄰苯二甲酸而無法生成原兒茶酸。因此，推測該菌株可能還有其他降解途徑，或者不能將PAEs完全降解為水和二氧化碳。

4 結論

（1）從長期覆蓋塑料廢棄物的垃圾場土壤中分離到一株以DMP為唯一碳源的菌株，經鑒定該菌株為副球菌屬，命名為Paracoccus sp.QD15-1，革蘭氏陰性，該菌株能降解多種PAEs。

（2）以DMP為唯一碳源，菌株Paracoccus sp.QD15-1生長的最適條件為pH 8，溫度30℃；該菌株是一株高效降解DMP的菌株，降解DMP過程符合一級動力學方程，隨著DMP初始濃度的增加，半衰期縮短。

（3）該菌株中含有2個降解PAEs的基因PAphtAb和PAphtB，推測其降解途徑為：DMP降解為鄰苯二甲酸單酯，其再分解為鄰苯二甲酸，通過PAphtAb和PAphtB的作用進一步降解。