銅綠假單胞菌對龍葵中Cd的亞細胞分布和化學形態的影響

張海利，王 濤，鄒路易，郁紅艷，顧文秀，滕 躍*

（1.江南大學環境與土木工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122）

Cd污染主要來自于人類的農業和工業活動，如廢水灌溉、金屬礦石的開采和冶煉等[1]。由于Cd具有生物毒性強、分布范圍廣、不能被生物降解且遷移性強等特點，使其易被植物吸收并積累，從而通過食物鏈富集，危害人類健康[2]。因此，Cd污染及其修復技術得到全球越來越多的關注[3]。

植物修復是一種成本低、環保的污染土壤修復技術，主要應用超積累植物修復受污染土壤。現已發現大量植物物種可超量積累重金屬[4-5]，但植物修復在實踐過程中仍存在局限性，其修復效率受多種因素的影響，如植物生長緩慢、生物量小、對重金屬的耐受性有限等[6]，而使用植物-微生物聯合修復重金屬污染土壤，是提高植物修復效率的有效方法[7-8]。

銅綠假單胞菌是一種具有金屬抗性的菌種，Zhang等[9]從煤礦區的污染土壤中分離出兩株銅綠假單胞菌菌株ZGKD5和ZGKD2，均對Cd、Cu、Zn、Ni和Pb表現出高耐受性。且大量研究表明，在植物修復盆栽實驗中，銅綠假單胞菌可促進植物生長，提高Cd積累量。例如，Liang等[10]的研究中，接種從重金屬污染的污泥中分離的銅綠假單胞菌顯著增強紫堇的Cd積累；Xie等[11]研究表明，接種銅綠假單胞菌ATCC 9027可緩解Cd的毒性，促進苧麻生長，并提高Cd積累；Biswas等[12]研究表明，從廢水中篩選出的銅綠假單胞菌KUJM具有多重重金屬抗性潛力，并促進扁豆種子生長，具有用于污染土壤植物修復的潛能。關于銅綠假單胞菌的研究均處于對植物生長和積累總量的水平，而銅綠假單胞菌如何影響植物重金屬積累和分布的其他方面仍不確定。

Cd超積累植物龍葵生長周期短、生物量大，且已被證明其耐受并吸收土壤中Cd[13]，具有良好的應用前景[14-16]。研究表明，植物的金屬耐受性和解毒機制可通過亞細胞分布限制毒素或改變其化學結構實現[17-19]。然而，銅綠假單胞菌對龍葵中Cd積累和分布的影響尚無報道。本研究以龍葵和從Cd污染土壤篩選出的銅綠假單胞菌為研究材料，采用差速離心法和化學試劑逐步提取法，通過研究龍葵各部位中Cd的積累、亞細胞分布和化學形態，來分析銅綠假單胞菌對其的影響，探討銅綠假單胞菌作用下龍葵對Cd的耐受機制，期望為龍葵在植物修復中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

盆栽實驗用土取自江蘇省江陰市農田土，風干后過2 mm篩。土壤理化性質：pH 5.59，總氮 1 g·kg-1，有機質 27.35 g·kg-1，速效磷 18.81 mg·kg-1，速效鉀75.46 mg·kg-1，Cd 2.64 mg·kg-1。

供試菌株為課題組從Cd污染土壤中已篩選出的Cd耐受性細菌，利用BLAST軟件將測得Cd耐受細菌基因序列與GenBank上相關的16S rDNA序列進行同源性比較，得出此菌與Pseudomonas aeruginosa銅綠假單胞菌同源性為99%。

1.2 實驗設置與處理

盆栽實驗土壤的Cd含量設4個水平分別為0、25、50、100 mg·kg-1，不同Cd濃度的土壤分為接種和不接種銅綠假單胞菌兩種情況，共8個處理，每個處理3次重復。Cd以CdCl2溶液的形式加入已過篩的土壤中充分攪拌，穩定2周后進行高溫滅菌（121℃，30 min）處理。將滅菌后的土壤裝入塑料盆（直徑18 cm，高11.5 cm）中，每盆均裝土2 kg。挑選優良的龍葵種子于70%的乙醇中浸泡30 min，無菌蒸餾水清洗3次，再于2%的NaClO2溶液中浸泡10 min后用蒸餾水洗凈，表面滅菌后種植盆中。接種組每周以細菌懸浮液的形式接種銅綠假單胞菌。將培養于LB固體培養基中的銅綠假單胞菌轉移至盛有50 mL的LB液體培養基的錐形瓶中，于恒溫振蕩器（150 r·min-1，37 ℃）中振蕩48 h，富集后離心（6000 r·min-1，4 ℃）10 min收集細菌細胞，再用生理鹽水洗滌兩次獲得OD600值近似為0.6的接種物（約108CFU·mL-1），每盆接種5 mL做接種處理[11，20]。所有實驗均在自然光照的溫室中進行，60 d后收獲植物，自來水沖洗后，去離子水洗凈，吸干表面水分。

1.3 植物亞細胞組分的分離

植物亞細胞組分的分離采用差速離心法，參考Weigel等[21]的方法，并略加改動。稱取根、葉鮮樣各0.2 g，加入 20 mL 預冷提取液[Tris-HCl（pH 7.5）50 mmol·L-1，蔗糖 250 mmol·L-1，DTT 1 mmol·L-1]，研磨勻漿后3000×g下離心15 min，沉淀為細胞壁組分（F1）；取上清液在12 000×g下離心30 min，沉淀為細胞器組分（F2）；上清液即為細胞可溶組分（F3）。全部操作在4℃下進行。

1.4 植物Cd化學形態提取

植株Cd的化學形態分析采用化學試劑逐步提取法。準確稱取根、葉鮮樣0.2 g，加入20 mL提取液研磨勻漿后轉入50 mL錐形瓶中，25℃恒溫振蕩22 h后，在5000×g下離心10 min，倒出上清液，再加入20 mL提取液，25℃恒溫振蕩2 h，在5000×g下離心10 min，倒出上清液，合并兩次上清液得該提取態組分樣品。沉淀加入下一種提取液進行下一輪的提取。5種提取液依次為：（1）80% 乙醇（FⅠ），提取硝酸鹽/亞硝酸鹽，氯化物和氨基苯酚鎘等無機Cd；（2）去離子水（FⅡ），提取水溶性Cd，Cd-有機酸絡合物和Cd（H2PO4）2；（3）1 mol·L-1NaCl溶液（FⅢ），提取果膠和蛋白質結合的Cd；（4）2% 醋酸（FⅣ），提取未溶解的鎘磷酸鹽，包括CdHPO4和Cd3（PO4）2；（5）0.6 mol·L-1鹽酸（FⅤ），提取草酸鎘；最后為殘留態（FⅥ）[22]。

1.5 Cd含量測定

將差速離心法和化學試劑逐步提取法分離得到的沉淀和上清液分別在電熱板上70℃加熱至近干，加入10 mL HNO3消煮至澄清，去離子水定容后使用ICP測定[23]。所有數據均使用SPSS 19進行單因素方差分析，使用Duncan新復極差法（SSR）在顯著水平小于0.05時作多重比較分析，使用Origin 8軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 龍葵對Cd的富集與特征

由表1可知，在未接種處理中，植株各部Cd含量均隨土壤中Cd濃度的增加而呈上升趨勢。植株莖和葉中富集的Cd含量隨土壤中Cd濃度的增加呈線性上升趨勢，兩者的富集能力并無下降或趨于飽和的現象。而龍葵根部在中低Cd濃度處理（0～50 mg·kg-1）時上升較快，在高Cd濃度處理（100 mg·kg-1）時趨于平緩。同時隨著土壤中Cd濃度增加，根-莖的轉運系數逐漸增加，而莖-葉的轉運系數逐漸降低。

接種銅綠假單胞菌可以促進Cd更多地向葉轉移。隨著土壤中Cd濃度的增加，接種處理的龍葵葉中Cd含量為未接種的1.14～1.60倍。除土壤Cd濃度為50 mg·kg-1外，根的Cd含量較未接種處理降低8.23%～23.82%。在低Cd濃度（0～25 mg·kg-1）中，接種處理增加莖中Cd含量，而中高Cd濃度（50～100 mg·kg-1）中，接種處理減少莖中的Cd含量。同時隨土壤Cd濃度增加，接種處理的根-莖轉運系數為未接種處理的1.13～1.22倍，莖-葉轉運系數為未接種的1.02～1.68倍。即接種銅綠假單胞菌可以促進植株內Cd向葉的轉移，使得龍葵葉中對Cd的富集能力加強。

2.2 龍葵中Cd的亞細胞分布

由表2可知，各亞細胞組分的Cd含量隨著土壤中重金屬濃度的增加而增加，且大多數Cd存在于細胞壁和可溶性組分中。龍葵根部各亞細胞組分Cd的分配比例為F1＞F3＞F2，即根中Cd主要分布于F1（細胞壁）中，且在高濃度（100 mg·kg-1）下，接種處理的根部F1組分中Cd的分配比例為未接種的1.42倍。同時隨著土壤中Cd濃度的增加，接種處理的根部F2組分（細胞器組分）中Cd的分配比例較未接種減少4.37%～27.85%。葉的亞細胞組分中Cd的分配比例為F3＞F1＞F2，即葉中Cd主要分布于F3（可溶組分）中，且接種處理可顯著增加可溶組分中Cd的含量。同時與根部類似，接種處理中葉的F2組分（細胞器組分）Cd的分配比例較未接種減少12.90%～45.74%。

2.3 龍葵中Cd的化學形態分布

由圖1可知，龍葵根部Cd的化學形態分布受到土壤中Cd濃度的影響，且以醋酸、鹽酸提取態和殘留態Cd為主導。而醋酸、鹽酸提取態和殘留態Cd對植物沒有或基本沒有毒害作用，是不活躍的化學形態。由圖2可以看出，土壤中Cd濃度為中低濃度（0～50 mg·kg-1）時，接種處理增加各提取態Cd的含量；土壤Cd為高濃度（100 mg·kg-1）時，接種處理使根中各化學形態Cd含量急劇降低，并低于未接種處理（FⅢ除外）。

表1 龍葵根、莖、葉中的Cd含量Table 1 The content of Cd in roots，stems and leaves of Solanum nigrum

表2 Cd在龍葵根、葉中的亞細胞分布Table 2 Subcellular distribution of Cd in roots and leaves of Solanum nigrum

圖1 龍葵根系中各提取態Cd含量分配比例Figure 1 The percentage of each extractable forms of Cd in roots of Solanum nigrum

由圖3、圖4可知，隨著土壤中Cd濃度的增加，葉中各化學形態Cd含量呈增加趨勢，且以活躍態（乙醇、去離子水和氯化鈉提取態）Cd為主導。通過接種處理，非活躍態（醋酸、鹽酸提取態和殘留態）Cd在葉中分配比例較未接種呈增加趨勢。且葉中較活躍的氯化鈉提取態Cd分配比例較未接種減少20.17%～26.19%，活性較低的醋酸提取態Cd分配比例較未接種基本呈增加趨勢。即接種處理可促進葉中Cd由活躍態向非活躍態的轉移。

3 討論

植物吸收何種化學形式的金屬以及植物如何將其分布到各組分中是影響重金屬污染土壤植物修復效果的重要因素之一。因此我們通過盆栽實驗，研究銅綠假單胞菌對超積累植物龍葵中Cd的亞細胞分布和化學形態的影響。

研究表明，在Cd脅迫下，接種處理增加龍葵葉中的Cd含量，且龍葵根-莖、莖-葉的轉運系數為未接種的1.02～1.68倍和1.13～1.22倍，促進植株中Cd由根部向地上部分的轉移。轉運系數是評估超積累植物從土壤中攝取金屬和將其從根部向地上轉移能力的重要參數。可以看出，接種銅綠假單胞菌促進了龍葵Cd的轉移過程，有助于減少根中Cd的積累量，從而減少重金屬對根部的抑制作用，促使土壤中更多Cd被龍葵攝取，這與Shi等[24]的報道一致。

圖2 龍葵根部各提取態Cd含量Figure 2 The content of each extractable forms of Cd in roots of Solanum nigrum

龍葵對Cd的耐受性受其在植株中分布情況的影響。研究表明，Cd脅迫下，龍葵各部的Cd主要分布在細胞壁和可溶組分中。本研究中龍葵根部各亞細胞組分Cd含量的分配比例為F1＞F3＞F2，其中F1（細胞壁）組分的Cd比例最高為58.31%，同時在高Cd濃度（100 mg·kg-1）下，接種處理中根部細胞壁組分的Cd比例較未接種提高42.22%。因此，高Cd脅迫下，細胞壁的保護作用顯著。細胞壁是保護原生質體免受重金屬毒性的第一道屏障，主要由纖維素、半纖維素、果膠和蛋白質組成，表面傾向于帶負電[25]，是重金屬螯合的有效點位。而將Cd隔離于細胞壁中是植物耐受Cd的機制之一[26]。據報道，微生物的接種可以影響植物中Cd的亞細胞分布，如Wang等[27]的研究表明，與未處理的植物相比，接種Arbuscular Mycorrhizal增加了根細胞壁中37.2%～80.5%的Cd，且細胞器中的Cd水平降低，與我們的研究結果相似。接種處理促進龍葵根中吸收的Cd更多地滯留在細胞壁上，進入原生質體的Cd又大多被主要由液泡組成的可溶性組分區隔化，從而細胞器組分的Cd比例較未接種降低，最高達27.85%。這減少了Cd對細胞的毒害作用，提高了龍葵對Cd的耐性。因此推測Cd脅迫下，接種銅綠假單胞菌可強化龍葵根中細胞壁的滯留作用，將Cd更多地存儲在植株生物活性較低的場所，從而達到對植株的保護。

圖3 龍葵葉片中各提取態Cd含量分配比例Figure 3 The precentage of each extractable forms of Cd in leaves of Solanum nigrum

圖4 龍葵葉片中各提取態Cd含量Figure 4 The content of each extractable forms of Cd in leaves of Solanum nigrum

不同化學形態的Cd具有不同的毒性程度和遷移能力，以乙醇、去離子水和氯化鈉提取的Cd具有較高的遷移能力并且對植物細胞的毒性高于醋酸、鹽酸提取態和殘留態的Cd[27]。本研究中，龍葵根部Cd化學形態分布以低活性態（醋酸、鹽酸提取態和殘留態）為主導，且土壤中Cd處于高濃度（100 mg·kg-1）時，接種銅綠假單胞菌使根中各化學形態Cd含量急劇降低，而葉中Cd含量顯著增高。由此可進一步驗證接種可促進Cd由根向葉的轉移，提高龍葵對Cd的耐受性。

葉中各亞細胞組分Cd的分配比例為F3＞F1＞F2，其中F3組分（可溶組分）的Cd比例最高為73.01%。接種銅綠假單胞菌可增強葉中可溶組分的Cd含量，可溶組分主要由液泡組成，液泡已被認為是重金屬積累的主要場所[26]，這種植物將吸收的Cd隔離于液泡中的過程稱為液泡區室化。因此可以認為液泡區室化在龍葵葉對Cd的解毒機制中占有重要地位，且接種處理可促進龍葵葉的液泡區室化作用。Wang等[27]的研究中，接種AM真菌處理的紫花苜宿在葉的可溶組分中積累更多的Cd，同我們的研究結果類似。同時，接種處理通過將Cd轉化為低活性形態，提高龍葵葉對Cd的耐受性，與Li等[28]的研究結果相似。在Cd脅迫下，接種處理增加植株葉中低活性形態（醋酸、鹽酸提取態和殘留態）Cd的比例，并且降低活性較高的氯化鈉提取態的Cd比例。這說明Cd脅迫下，接種銅綠假單胞菌可以促使進入龍葵葉的Cd由結合態更多地向活性更低且難溶于水的磷酸鹽、草酸鎘和殘渣態轉化，降低葉中Cd的毒性和遷移能力，從而減輕Cd對植物的毒害。

4 結論

接種銅綠假單胞菌提高了龍葵地上部分的Cd含量，促進了Cd由根部向地上部分的轉移，增加了根中細胞壁組分和葉中可溶組分的Cd含量，同時降低根和葉中細胞器組分的Cd比例。此外，接種銅綠假單胞菌增加了葉中低活性形態Cd的比例。綜上所述，本研究表明，接種銅綠假單胞菌可通過改變Cd在植株中的分布和形態比例，促進根的細胞壁滯留作用和葉的液泡區室化作用，促進葉中Cd向活性更低的形態轉變，從而加強龍葵對Cd的耐受性。