鎘低積累青菜品種篩選及硫對鎘脅迫下青菜鎘含量和品質影響

杜小平，康靖全，呂金印

（西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100）

近年來，隨著我國工業化、城鎮化快速發展，以及對化肥、污水灌溉和采礦活動的過度依賴，農業土壤重金屬污染日趨嚴重[1]。據統計，人類活動每年向土壤排放鎘（Cd）9.9～45.0萬t[2]。我國受重金屬污染的耕地面積近2000萬hm2，約占耕地面積的1/5，其中Cd污染耕地占1.33萬hm2，涉及11個省25個地區[3]。重金屬可以在土壤中和作物體內積累，通過食物鏈進入人體，對人體健康造成潛在的威脅[4]。減少Cd進入食物鏈的可能途徑：一是調節土壤中Cd的生物有效性；二是利用或培育吸Cd量少或Cd優先吸附在非可食部分的植物品種。Cd低積累作物品種[Low Cd accu?mulating cultivars（LCACs）]要求生長在Cd污染土壤中作物可食部分Cd積累量低于食品安全國家標準（GB 2762—2012），而選育Cd低積累作物品種是建立在同一物種不同品系對Cd吸收和遷移的遺傳穩定差異上。研究表明，已根據一些主要農作物可食部分Cd積累量篩選出Cd低積累品種，如水稻（Oryza sativa L.）[5-8]、小麥（Triticum aestivum L.）[9-10]、玉米（Zea mays L.）[11]和白菜（Brassica perkinensis L.）[12]等，尤其是杜蘭小麥，作為第一種成功選育的商業化Cd低積累農作物，已在加拿大種植很多年[13]。目前更多的研究主要集中在農作物上，但對蔬菜的研究報道較少，尤其是特別容易遭受土壤Cd污染的葉類蔬菜[14]。

硫是植物生長僅次于氮、磷、鉀的第四要素，并在逆境應答中起著重要作用[15-16]。大量研究證實，硫在植物抵抗Cd毒害的過程中起著重要的作用。衣純真等[17]研究表明，施用K2SO4能顯著減少水稻對Cd的吸收，降低水稻葉、莖、谷殼以及糙米中的Cd含量。梁泰帥等[15]研究發現外施Na2SO4能明顯促進小白菜生長和光合作用，減少Cd從根部向地上部轉運，從而降低小白菜地上部Cd含量。由此可見，外施硫能夠增強植物對Cd脅迫的抗性或耐受性。

青菜（Brassica chinensis L.）又稱小白菜，是十字花科蕓薹屬植物，作為我國一種重要的葉類蔬菜，在南北方廣泛栽培和食用[15，18]。Arthur等[19]根據作物體內Cd的積累量認為：十字花科是Cd高積累作物。李博文等[20]和張曉晴等[21]研究認為菜花、萵苣和小白菜等為重金屬中度積累性。故篩選、種植重金屬低積累青菜品種有助于降低長期食用青菜所帶來的健康風險。本研究通過人工模擬土壤污染采用盆栽和大田小區試驗，以36個不同基因型青菜品種為試驗材料，根據可食部分生物量變化和Cd積累量差異，篩選出Cd高積累和Cd低積累青菜品種，并通過外施硫在大田小區進一步降低可食部分Cd含量，以期為確保食物安全及提高蔬菜營養品質提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 盆栽試驗

1.1.1 供試青菜品種

青菜（Brassica chinensis L.）品種共36種，均購自相關作物種業研究所。供試青菜名稱及其提供商見表1。

1.1.2 供試土壤

供試土壤取自陜西關中地區大田耕作層土（0～20 cm），土壤類型為土墊旱耕人為土（關中塿土），基本理化性質為：pH 8.02，有機質12.57 g·kg-1，速效氮、速效磷、速效鉀分別為 64.29、19.58、78.62 mg·kg-1，全硫138.42 mg·kg-1，有效硫 7.24 mg·kg-1，總 Cd 0.13 mg·kg-1。

1.1.3 試驗設計

盆栽試驗在西北農林科技大學試驗基地進行。將供試土壤均勻攤開，風干后過5 mm篩，裝入聚乙烯塑料盆（18 cm×15 cm）中，每盆裝土2.5 kg。Cd試劑為CdCl2·2.5H2O。以溶液形式均勻噴灑施入Cd溶液。共設3個Cd處理水平（0、1、5 mg·kg-1）模擬Cd污染土壤，分別編號為CK、Cd1、Cd5。每個處理水平設置3次重復。裝盆前每千克干土施尿素0.324 g，磷酸二氫鉀1.25 g，氯化鉀0.158 g。攪拌均勻，平衡60 d。挑選籽粒飽滿的青菜種子播種，每盆播種10粒，待植株生長至3片真葉間苗至5株。生長35 d后收集全部植株，測定各項生理指標。

1.2 小區試驗

1.2.1 供試青菜品種

供試品種為盆栽篩選獲得2個Cd低積累品種紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH），及2個Cd高積累品種壺瓶長梗白（HPCGB）和抗熱605（KR605）。

表1 供試青菜品種及來源Table 1 Tested cultivars of pakchoi and their providers

1.2.2 小區試驗設計

試驗地點及供試土壤同1.1.2。在大田模擬Cd污染土壤，設置5個處理水平（試驗因素與水平見表2），每個處理水平為一個小區（長×寬×深，1.2 m×1.0 m×0.25 m），利用泡沫板和塑料布對每個小區做防滲漏處理，每個小區裝土150 kg，以溶液形式均勻噴灑施入CdCl2·2.5H2O和Na2SO4，與土壤攪拌均勻，平衡60 d。每個小區播種4個品種，生長35 d后收集全部植株，測定各項生理指標。

表2 試驗因素與水平Table 2 Experimental factors and levels

1.3 測定項目和方法

1.3.1 生物量測定

取植株樣，用自來水反復沖洗，最后用去離子水洗凈，濾紙吸干多余水分。105℃殺青15 min，于80℃烘干至恒重，測定干物質量。

1.3.2 重金屬Cd含量測定

將青菜樣品研磨并過100目篩，稱取0.5 g青菜樣品可食部分，加入10 mL混合酸HNO3-HClO4（4∶1，V/V），220℃沙浴消解至透明色，采用火焰原子吸收分光光度計（Z-2000賽曼，日立公司）測定Cd含量。土壤風干后機械粉碎，過100目篩，稱取2.0 g土壤樣品于錐形瓶中，加入少許去離子水濕潤，然后加入15 mL HNO3，于電熱板上緩慢加熱分解，并加以回流，蒸至近干；稍冷后加入HNO3-HClO4（4∶1，V/V）10 mL，220℃沙浴消解，蒸至近干；稍冷卻后反復加入10 mL HNO3，待樣品蒸至近灰白色，定容至25 mL，上清液用火焰原子吸收分光光度計測定土壤Cd含量。

1.3.3 品質指標測定

選取青菜植株從第1片展開葉向下數的第4片成熟功能葉作為材料，進行品質指標測定：可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法[22]；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[22]；硝酸鹽含量采用GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[23]第三法紫外分光光度法測定；維生素C含量采用2，6-二氯靛酚比色法[24]。

1.4 Cd低積累品種（LCACs）篩選標準

研究Cd在不同品種間積累差異，綜合考慮農產品產量和質量。根據以往的文獻和前期的研究結果[18，25-26]，本試驗中Cd低積累品種篩選標準應符合以下兩個指標。一是Cd低積累品種可食部分的Cd含量不應超過食品安全國家標準最大限量值（GB 2762—2012），即青菜可食部分Cd含量最大限度為0.2 mg·kg-1。中國蔬菜地土壤Cd污染實地調查數據和土壤環境質量標準（GB 15618—1995）表明，“低等Cd污染土壤”Cd濃度范圍為0.3～0.6 mg·kg-1，“中等Cd污染土壤”Cd濃度范圍為0.6～1 mg·kg-1，“高Cd污染土壤”Cd濃度超過1 mg·kg-1。二是在污染土壤條件下，Cd低積累品種具有一定耐受性，其地上部分生物量不會呈現明顯下降。

1.5 分析指標

選用Cd脅迫下青菜生物量響應（Biomass re?sponse to stress，BRS）作為評價指標[18，25，27]，青菜的耐性特征：

式中：B5和Bck分別代表5 mg·kg-1Cd和對照條件下青菜可食部分生物量。

1.6 數據處理與分析

采用OriginPro 2016軟件進行圖形處理，SPSS 20.0進行方差分析，通過最小顯著法（LSD）檢驗差異顯著性水平（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫下青菜生物量變化

Cd處理下不同基因型青菜可食部分生物量存在顯著差異（p＜0.01）（表3）。在CK、Cd1、Cd5處理下，36個青菜品種可食部分生物量分別為0.385～1.984、0.549～1.420、0.392～1.277 g·株-1DW，每株可食部分生物量均值分別為1.005±0.296、0.916±0.215、0.782±0.233 g DW。根據雙因素方差分析，青菜可食部分生物量受青菜品種（p＜0.01）、土壤Cd濃度（p＜0.01）及兩者交互作用（p＜0.01）的顯著影響（表3）。

表3 Cd脅迫下36個青菜品種可食部分生物量及Cd含量Table 3 Edible parts biomass and Cd contents of 36 pakchoi cultivars under Cd stress

以Cd脅迫下青菜生物量的響應（BRS）作為評價指標（圖1）。36個青菜品種的BRS指標數值在-62.5%～96.4%，與對照CK相比，Cd5處理下，22個青菜品種（59.5%）可食部分生物量呈現顯著下降，對Cd脅迫表現敏感，5個青菜品種地上部分生物量呈現顯著性增加，9個品種（25%）生物量差異不顯著，包括WYM、LX、TCSH、SZQ、DYHDT、ZLL、LZX、SHQ和 AJH（圖1）。表明36個青菜品種對Cd的耐受性差異明顯，Cd脅迫抑制絕大部分青菜品種的生長。

2.2 Cd脅迫下青菜可食部分Cd積累

圖1 Cd脅迫下36種青菜品種可食部分生物量響應Figure 1 Edible parts biomass response to stress（BRS）of 36 pakchoi cultivars

在CK、Cd1和Cd5處理下，不同青菜品種可食部分Cd含量差異顯著（p＜0.05）。36個青菜品種CK、Cd1、Cd5處理下可食部分Cd含量分別為0.011～0.125、0.144～0.559 mg·kg-1FW 和 0.337～1.242 mg·kg-1FW，均值分別為 0.044±0.032、0.292±0.107、0.741±0.251 mg·kg-1FW（表3）。

由圖2可知，對照組36個青菜品種可食部分Cd含量均低于食品安全國家標準GB 2762—2012（Cd＜0.2 mg·kg-1FW）。1 mg·kg-1Cd處理時，有8個青菜品種可食部分 Cd含量低于0.2 mg·kg-1，包括：SJXBC、ZLL、HBC、AJH、ZYHYD、SZQ、SYB和LYM。然而，當Cd濃度為5 mg·kg-1時，36個青菜品種可食部分Cd含量均超過食品安全國家標準，在該污染條件下，36個待測品種均不符合Cd低積累品種（LCACs）。表明Cd低積累品種雖然在低Cd污染土壤中可食部分Cd含量低于食品安全國家標準，但在高Cd污染土壤條件下卻超過食品安全國家標準。

2.3 Cd低積累品種的篩選

在Cd1和Cd5處理下，不同青菜品種可食部分Cd含量呈現顯著正相關（P=0.000 3）（圖3）。根據生物量響應脅迫指數和Cd含量綜合評測，在Cd1脅迫下，36個待測青菜品種中8個品種可食部分Cd含量低于食品安全國家標準，表明這8個品種符合Cd低積累品種（LCACs）第一條篩選標準。但在Cd5處理下，5個青菜品種SYB、HBC、SJXBC、ZYHYD和LYM呈現較強敏感性，其可食部分生物量顯著下降，分別降低36.53%、22.45%、43.04%、48.70%和 35.66%，表明僅有3個青菜品種ZLL、AJH和SZQ符合兩條篩選指標。在Cd5脅迫下，ZLL、AJH和SZQ可食部分Cd含量分別為食品安全國家標準（0.2 mg·kg-1）的1.89、2.45倍和4.9倍，因此，選擇ZLL和AJH為Cd低積累青菜品種。

圖3 Cd1和Cd5處理下36種青菜品種可食部分Cd含量相關性Figure 3 Correlation of Cd contents in edible parts of 36 pakchoi cultivars between Cd1 and Cd5 treatments

在所有待測36個青菜品種中，壺瓶長梗白（HPC?GB）和抗熱605（KR605）具有較高的可食部分Cd積累量，將其作為典型Cd高積累青菜品種，與2個篩選的Cd低積累品種紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH）在大田小區條件下，探究外施硫對青菜可食部分Cd含量和蔬菜品質的影響。

2.4 硫對Cd污染土壤中青菜可食部分Cd含量的影響

圖2 不同濃度Cd脅迫對36個青菜品種可食部分Cd含量的影響Figure 2 The Cd contents of 36 pakchoi cultivars in edible parts under different Cd treatments

表4 外施硫對Cd脅迫下青菜可食部分Cd含量的影響（mg·kg-1FW）Table 4 Effects of exogenous sulfur on the Cd contents in edible parts of pakchoi under Cd stress（mg·kg-1FW）

表4結果表明，兩組不同積累型青菜品種可食部分Cd含量隨著Cd處理水平的增加呈現顯著升高趨勢。2個Cd低積累品種紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH）可食部分Cd含量在Cd1、Cd5、Cd1+S50和Cd5+S50處理下均顯著低于2個Cd高積累品種壺瓶長梗白（HPCGB）和抗熱605（KR605），且隨著Cd處理濃度增加兩組不同積累型青菜品種間差異顯著增加。與單一Cd處理相比，外施硫降低了可食部分Cd含量。Cd5處理下，外施硫對青菜品種壺瓶長梗白（HPC?GB）、抗熱605（KR605）和矮腳黃（AJH）可食部分Cd含量分別顯著降低33.33%、37.84%和27.54%，而其他處理下對可食部分Cd含量降低幅度均不顯著。Cd1處理下，僅有Cd低積累品種紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH）可食部分Cd含量低于食品安全國家標準GB 2762—2012（Cd＜0.2 mg·kg-1），說明在一定污染條件下，Cd低積累品種種植符合食品安全。

2.5 硫對Cd污染土壤中青菜品質指標的影響

由圖4可知，隨著Cd處理水平的增加，Cd高積累品種壺瓶長梗白（HPCGB）和抗熱605（KR605）可食部分可溶性蛋白和可溶性糖含量均呈增加趨勢，Cd低積累品種紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH）呈先升后降趨勢。與CK相比，Cd5處理下，壺瓶長梗白（HPCGB）可食部分可溶性蛋白和可溶性糖含量分別顯著增加39.23%和34.64%，抗熱605（KR605）可食部分可溶性糖含量增加了38.22%，而紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH）可食部分在Cd1處理水平下，可溶性蛋白含量分別顯著增加37.65%和39.47%，可溶性糖含量分別顯著增加34.71%和38.88%，而其他處理水平下含量變化不明顯。外施硫不同程度提高Cd脅迫下青菜可食部分可溶性蛋白和可溶性糖含量，在Cd5處理水平下，外施硫將紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH）可溶性糖含量分別提高21.76%和19.99%，差異顯著。而其余處理水平下，外施硫對4種青菜可食部分可溶性蛋白和可溶性糖的影響差異均不顯著。

對照CK條件下，青菜可食部分硝酸鹽含量均低于國家標準葉菜類硝酸鹽含量≤3000 mg·kg-1FW（GB 18406.1—2001）。與CK相比，Cd脅迫顯著增加了4個青菜品種可食部分硝酸鹽含量（圖4），Cd5處理下，壺瓶長梗白（HPCGB）和抗熱605（KR605）可食部分硝酸鹽含量顯著增加了29.55%和36.54%，紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH）可食部分硝酸鹽含量顯著增加了62.41%和50.72%，均超過食品安全國家標準葉菜類硝酸鹽限量標準；Cd1處理濃度下，抗熱605（KR605）和矮腳黃（AJH）可食部分硝酸鹽含量顯著增加了31.19%和11.81%，超過國家標準葉菜類硝酸鹽限量標準，而紫羅蘭（ZLL）可食部分硝酸鹽含量顯著增加了21.27%，但未超標。與單一Cd處理相比，外施硫降低青菜可食部分硝酸鹽含量，且均低于食品安全國家標準葉菜類硝酸鹽含量。在Cd1處理條件下，ZLL可食部分硝酸鹽含量降幅最高，達到41.30%。

與CK相比，Cd脅迫顯著增加了壺瓶長梗白（HPCGB）和矮腳黃（AJH）可食部分維生素C含量，而抗熱605（KR605）和紫羅蘭（ZLL）可食部分維生素C含量呈現降低趨勢。Cd5處理水平下，壺瓶長梗白（HPCGB）可食部分維生素C含量增加了38.61%，抗熱605（KR605）可食部分維生素C含量降低了34.94%，差異顯著。外施硫增加了可食部分維生素C含量，Cd5處理水平下，抗熱605（KR605）可食部分維生素C含量顯著提高了51.92%，Cd1處理下，外施硫對青菜可食部分維生素C含量影響不明顯。

3 討論

圖4 外施硫對Cd脅迫下青菜可食部分可溶性蛋白、可溶性糖、硝酸鹽和維生素C含量的影響Figure 4 Effects of exogenous sulfur on the contents of soluble protein，soluble sugar，nitrate and vitamin in edible parts of pakchoi under Cd stress

Cd可以通過根系進入植物體內，過量積累對植物生長和食品安全造成不利影響，嚴重威脅人類健康[28-29]。篩選和培育重金屬低積累作物品種被認為是一種應對土壤重金屬污染的有效和合理的途徑。Liu等[30]和Wang等[31]對Cd低積累大白菜品種篩選時提出，Cd脅迫生物量耐受性應該作為Cd低積累品種鑒定指標之一；Wang等[32]指出植物對Cd污染具有一定抗性，產量降低和植物毒害癥狀不能及時和有效反映葉類蔬菜Cd污染，易于造成食品安全風險。本研究表明，不同Cd處理水平下36個青菜品種間可食部分生物量達到極顯著差異。與CK處理相比，Cd5處理水平下，59.5%的青菜品種可食部分生物量降低趨勢顯著，25%的青菜品種生物量對Cd脅迫表現不敏感。青菜品種易受到重金屬Cd污染，可食部分Cd含量不應超過食品安全國家標準GB 2766—2012（Cd＜0.2 mg·kg-1）。在Cd1處理水平下，77.78%的青菜品種可食部分Cd含量超過食品安全國家標準，Cd5處理下，所有青菜品種可食部分Cd含量均超過0.2 mg·kg-1。本研究篩選出來的2個Cd低積累品種紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH），與對照CK相比，可食部分生物量在Cd1和Cd5處理水平下差異均不顯著，可食部分Cd含量在Cd1處理下低于0.2 mg·kg-1，Cd5處理水平下分別超過國家標準1.89倍和2.45倍。表明Cd脅迫對大多數青菜品種生長具有抑制作用，隨著Cd處理水平的增加，青菜品種可食部分Cd含量急劇增加，Cd低積累品種在Cd中低污染（Cd＜1 mg·kg-1）條件下種植符合食品安全國家標準。

城郊作為無公害蔬菜生產基地，由于工業“三廢”和農用化學物質排放，土壤極易受到各種污染，造成蔬菜重金屬含量超標和品質降低。硫是植物必需的6種大量元素之一，在植物體內的含量為3%～5%，是含硫氨基酸Met（甲硫氨酸）和Cys（半胱氨酸）、GSH（谷胱甘肽）和PCs（植物絡合素）等重要組成成分，廣泛參與植物體內各種代謝酶促反應，緩解重金屬對植物的毒害作用，提高蔬菜品質[33]。潘瑤等[34]研究發現施硫能顯著降低水稻根系中Cd向地上部分轉移，地上部分Cd積累量更容易受到施硫水平影響。梁泰帥等[15]研究發現外施50 mg·kg-1硫能顯著降低小白菜地上部Cd含量，同時顯著增加小白菜葉片可溶性蛋白、可溶性糖和抗壞血酸含量。本研究中，外施硫降低了青菜可食部分的Cd含量，Cd5處理下，壺瓶長梗白（HPCGB）、抗熱605（KR605）和矮腳黃（AJH）可食部分Cd含量分別顯著降低了33.33%、37.84%和27.54%，可能原因，一是土壤中硫通過改變自身形態與重金屬發生反應，影響土壤重金屬的生物有效性[35-36]；二是植物體中的硫代謝產物GSH在谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）的作用下與進入細胞內的Cd2+形成復合物，維持細胞內離子平衡[37]。同時GSH作為植物螯合肽PCs的合成底物，參與PCs合成，低分子量的PCs與Cd2+形成復合物Cd-PCs，可通過液泡膜轉運體進入液泡，與液泡中的硫化物形成高分子狀態的Cd-PC-S復合物，固定更多的Cd在液泡中[38]；三是硫對Cd根部向地上部運輸具有拮抗作用[15]。外施硫能改善Cd脅迫下青菜品質，提高青菜產品中可溶性蛋白、可溶性糖和維生素C含量，降低硝酸鹽含量。這與前人在大蒜[39-40]、玉米[41]和大豆[42]上的研究結果一致。本研究中，Cd5處理濃度下，外施硫提高青菜可食部分可溶性蛋白、可溶性糖和維生素C含量，其中2個Cd低積累品種紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH）可食部分可溶性糖含量分別顯著增加21.76%和19.99%，Cd高積累品種抗熱605（KR605）可食部分維生素C含量顯著提高了51.92%?？赡苁擎k硫交互處理增加了青菜體內非蛋白巰基、谷胱甘肽和絡合素以及抗壞血酸-谷胱甘肽循環關鍵酶的活性，從而增強青菜對Cd脅迫的耐受性，提高了青菜營養品質[43-44]。另外，外施硫能在一定程度上降低青菜可食部分硝酸鹽含量?？赡苁侵参锏牡虼x具有相互偶聯的關系[45-46]，適量的外施硫能提高植株氮代謝限速關鍵酶NR（硝酸還原酶）活性和氮素同化效率，促進代謝過程，降低硝酸鹽的積累[47]，同時外施硫能夠提高PSⅡ電子傳遞能力和羧化反應速率，從而促進光合碳同化，在碳骨架和能量供應上間接拉動了氮代謝的還原同化[48]；另一方面蔬菜是喜硝植物，雖然能吸收形態，但以態為多，硫元素進入土壤后，在微生物的作用下，硫與氧發生反應產生，根據植物根部吸收養分離子交換原理，可能由于具有與競爭置換，緩解蔬菜根部嗜好性過量吸收的作用，并加速蔬菜體內的生理生化過程，促進體內的轉化，減少滯留時間和累積[49]。

4 結論

（1）不同青菜品種可食部分對Cd的積累差異明顯，本研究中篩選的Cd低積累品種紫羅蘭（ZLL）和矮腳黃（AJH）在Cd中、低污染（Cd＜1 mg·kg-1）條件下，其可食部分Cd含量低于食品安全國家標準限量（0.2 mg·kg-1），可作為Cd安全青菜品種。

（2）與對照相比，Cd中、低污染（Cd＜1 mg·kg-1）提高了青菜可食部分可溶性蛋白、可溶性糖和硝酸鹽含量，而Cd高污染（Cd＞1 mg·kg-1）條件下2個Cd低積累青菜品種可食部分可溶性蛋白和可溶性糖含量低于對照。

（3）外施50 mg·kg-1硫可不同程度降低Cd脅迫下青菜可食部分Cd含量和硝酸鹽含量，提高可食部分可溶性蛋白、可溶性糖和維生素C含量，改善青菜營養品種。