基于納米金/蔗糖酶構建核酸適體傳感器檢測鹽酸多巴胺

姜利英，劉 帥，任林嬌，張 培，趙學偉，王延峰

臨床實踐中，多巴胺含量的檢測對神經(jīng)性食欲缺乏癥、阿爾茨海默病和帕金森癥等疾病的診斷和治療有重要作用[1-3]。但是多巴胺化學性質(zhì)不穩(wěn)定，在空氣環(huán)境中易被氧化，故實際檢測中，一般以鹽酸多巴胺[4-5]（dopamine hydrochloride，DH）代替人體內(nèi)的多巴胺。目前檢測DH的方法主要有高效液相色譜法[6]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、免疫分析法[8-9]。這些方法往往需要專業(yè)的實驗設備，操作繁瑣且檢測成本較高。

核酸適體能與特定靶目標進行高特異性和強親和力結合，功能與抗體相似，并且憑借其較抗體更易合成、易修飾、易保存和高穩(wěn)定性的特點，被越來越多的用來制備核酸適體傳感器[10-13]。便攜式血糖儀[14-15]能夠?qū)ρ牵ㄆ咸烟牵┻M行準確的測量，并且具有體積小、成本低和操作簡單的特點，然而檢測目標單一，限制了其應用和發(fā)展?jié)摿Α：怂徇m體傳感器結合血糖儀用于檢測非糖靶目標吸引了研究人員的興趣與關注，Yu Xiang等[16]利用蔗糖酶作為中介物質(zhì)，將被測物質(zhì)濃度與蔗糖酶的催化產(chǎn)物葡萄糖濃度相關聯(lián)，通過血糖儀檢測葡萄糖濃度實現(xiàn)了對DNA分子的檢測，目前已擴展到大腸桿菌[17]、肌紅蛋白[18]、Cu2＋[19]等非糖物質(zhì)的檢測。

近年來，納米技術在分析和診斷領域應用廣泛，納米材料[20-22]（金屬納米材料、量子點、硅納米材料等）的合成及應用取得了較大進展。納米金由于小尺寸效應[23-24]、催化活性[25-26]、易修飾等[27]獨特性質(zhì)，成為廣泛關注的熱點，用于新型傳感系統(tǒng)的開發(fā)有助于構建簡單、靈敏度高、選擇性好的納米金-適體傳感器[28-32]。

本實驗基于納米金/蔗糖酶構建核酸適體傳感器，利用納米金較大的比表面積固定蔗糖酶實現(xiàn)對檢測信號的轉換與放大，基于核酸適體與靶目標強親和力結合的競爭機制，結合血糖儀實現(xiàn)了對DH的檢測，具有操作簡便、檢測成本低、特異性好的特點。通過選擇合適的核酸適體容易實現(xiàn)對致病菌、抗生素等的特異靈敏檢測，在醫(yī)療衛(wèi)生和食品安全領域具有較大的研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠體金溶液（20 nm）、DH、蔗糖酶 南京諾唯贊生物科技有限公司；去甲腎上腺素、尿酸和引物上海生工生物工程有限公司；其中引物：DNA1（DH核酸適體）：5’-GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGG CCA GCA CAG AAT GAG GCC C-(CH2)3-SH-3’；DNA2（DNA1的互補鏈）：5’-GTG TTC TCT GGC GCA CAC AGA GAC ACA GAA TGA GGC CC-(CH2)3-SH-3’；實驗用水是電阻為18.2 MΩ的超純水；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.3）；Tris-醋酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 5.2）；蔗糖溶液（0.5 mol/L）和蔗糖酶溶液（1 mg/mL），用PBS做溶劑配制；三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP）溶液（0.01 mol/L）和巰基乙醇溶液（1 mmol/L），用Tris-醋酸緩沖液做溶劑配制。

1.2 儀器與設備

GL-16II型離心機 上海安亭科學儀器廠；HZQ-F200型振蕩培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；07HWS-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 杭州儀表電機有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；羅氏血糖儀 強生醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 傳感器的構造及檢測原理

核酸適體傳感器結合血糖儀檢測DH的原理如圖1所示。首先將DNA1（DH核酸適體）固定于修飾有納米金的96微孔板上做捕獲探針，再加入納米金-蔗糖酶-DNA2檢測探針，兩者通過堿基互補配對結合。未加入DH時，檢測探針結合在微孔板上；加入DH，由于核酸適體與DH的特異性結合力大于堿基互補配對力，所以檢測探針脫離微孔板進入上清液中，其脫離量與加入的DH量呈正相關。取出上清液加入蔗糖，蔗糖被檢測探針上的蔗糖酶水解為葡萄糖，葡萄糖的量與檢測探針的量呈正相關，故建立起葡萄糖與DH之間的線性關系，并通過血糖儀檢測葡萄糖濃度間接檢測DH濃度。

圖1 基于血糖儀檢測的DH核酸適體傳感器Fig. 1 Schematic demonstration of dopamine hydrochloride aptasensor based on the detection of glucometer

1.3.2 捕獲探針DNA1的固定

96微孔板作為DNA1的固定平臺，第1步進行納米金修飾，第2步進行DNA1固定。第1步，微孔中加50 μL 16 mol/L的濃硝酸處理2 h，純水沖洗3 次，再加入100 μL膠體金溶液，37 ℃培養(yǎng)24 h，純水沖洗3 次，其中微孔板的材料為聚苯乙烯，具有疏水性，與同為疏水性的納米金通過疏水作用力結合[33]，而進行濃硝酸處理，使表面被腐蝕，增大了納米金的固定量。第2步，DNA1用TCEP稀釋至0.5 μmol/L，活化1 h，取100 μL加入微孔中，DNA1通過S-Au鍵結合于納米金，37 ℃培養(yǎng)16 h，再加入50 μL巰基乙醇，37 ℃封閉1 h，最后用50 μL的PBS沖洗3 次，至此完成捕獲探針DNA1的固定。

1.3.3 納米金-蔗糖酶-DNA2檢測探針的制備

首先將500 μL蔗糖酶與1 mL膠體金混合，4 ℃培養(yǎng)6 h，再加10 μL 20 μmol/L DNA2（PBS作溶劑），37 ℃振蕩16 h（50 r/min），混合液12 000 r/min離心15 min，離心底物用純水沖洗3 次，洗掉未與納米金結合的蔗糖酶和DNA2，最后離心底物加入1 mL PBS溶解，4 ℃保存?zhèn)溆茫链送瓿杉{米金-蔗糖酶-DNA2檢測探針的制備。

1.3.4 DH的檢測

將100 μL檢測探針加入到固定有DNA1的微孔中，檢測探針與捕獲探針通過堿基互補配對結合，37 ℃培養(yǎng)2 h，用PBS沖洗3 次（沖洗掉未結合的檢測探針）。加入100 μL不同濃度DH溶液（PBS做溶劑），37 ℃培養(yǎng)2 h，取出微孔板的上清液，并用10 μL的PBS沖洗2 次，將上清液和沖洗液加入離心管，再加入30 μL的蔗糖溶液，37 ℃培養(yǎng)30 min，取2 μL最終培養(yǎng)液用血糖儀檢測信號強度。

2 結果與分析

2.1 反應時間優(yōu)化

由于實驗過程涉及到生化反應，為了使反應進行充分，并且在最短的時間內(nèi)獲得較好的實驗結果，需對反應時間進行優(yōu)化。

2.1.1 DH孵育時間優(yōu)化

圖2 DH孵育時間對血糖儀信號強度的影響Fig. 2 Influence of dopamine hydrochloride incubation time on the glucose meter signal intensity

選擇1 mmol/L和5 mmol/L DH，在不同孵育時間下使用血糖儀檢測最終葡萄糖濃度，對DH孵育時間進行優(yōu)化，如圖2所示。30 min之前，信號強度隨時間延長而增強，此時DH與核酸適體的競爭結合使檢測探針脫離捕獲探針并催化蔗糖為葡萄糖，檢測探針的脫離量隨DH孵育時間的延長而增多；30 min之后，信號強度逐漸趨于穩(wěn)定，此時DH與核酸適體競爭結合完成，檢測探針的脫離量不變，其與多巴胺的孵育時間無關，只與DH的加入量有關。故DH的孵育時間最短應選擇30 min。

2.1.2 蔗糖酶的催化反應時間優(yōu)化

選擇1 mmol/L和5 mmol/L DH，在不同催化時間下使用血糖儀檢測最終葡萄糖濃度，對蔗糖酶催化時間進行優(yōu)化，結果如圖3所示。120 min之前，信號強度隨時間的延長而增強，此時檢測探針上的蔗糖酶催化蔗糖生成葡萄糖，葡萄糖的生成量與反應時間有關；120 min之后，信號強度逐漸趨于穩(wěn)定，此時蔗糖酶完成催化，葡萄糖的生成量與反應時間無關，只與蔗糖酶的量（檢測探針的量）有關。故蔗糖酶催化反應時間最短應選擇120 min。

圖3 酶的催化反應時間對血糖儀信號強度的影響Fig. 3 The influence of enzymatic reaction times on the signal intensity of glucose meter

2.2 傳感器的線性檢測范圍

在上述實驗條件下，加入不同濃度DH（0.45、0.70、1.00、1.50、2.00、2.50、4.00、5.00、10.00 mmol/L）進行檢測，血糖儀的信號強度與DH濃度在0.45～10 mmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關系：Y=0.343 6＋1.168 4X（其中Y為血糖儀信號強度，X為DH濃度），相關系數(shù)R為0.997，檢出限（樣品中目標分析物能被準確檢出的最小量）為0.45 mmol/L。

2.3 傳感器的準確性與精確性測定結果

使用血糖儀對DH標準曲線的高中低3 個水平（8.0、3.0、0.8 mmol/L）標準液進行測定（樣本數(shù)n=5），最終的葡萄糖濃度如表1所示。將葡萄糖濃度代入標準曲線計算DH濃度，結果如表2所示。8.0、3.0、0.8 mmol/L的DH標準液使用該傳感器的檢測值分別為7.940、2.958、0.838 mmol/L，標準差為0.071 8、0.040 2、0.040 2 mmol/L，相對標準偏差（relative standard deviations，RSD）為0.9%、1.4%、4.8%。故該傳感器對DH檢測具有較好的準確性和精確性，且對高濃度DH檢測的RSD較小。

表1 葡萄糖的測量結果Table 1 Results of glucose detection after adding different concentrations of dopamine hydrochloride

表2 DH的測量結果Table 2 Results of detection of different concentrations of dopamine hydrochloride

2.4 傳感器的特異性測定結果

選擇DH標準曲線上的一個濃度（0.45 mmol/L），在相同實驗條件下，檢測同濃度的尿酸、去甲腎上腺素、Na＋、K＋溶液，結果如圖4所示。DH的血糖儀信號強度要明顯強于尿酸等干擾物的信號強度，且在實驗全程中，采用保鮮膜對微孔板進行物理封閉，減少非特異性背景信號，故該傳感器對DH檢測具有特異性。

圖4 DH檢測的特異性（0.45 mmol/L）Fig. 4 Specific detection of dopamine hydrochloride (0.45 mmol/L)

3 結 論

利用核酸適體與靶目標的親和力強于核酸適體與互補鏈間的堿基力原理，基于納米金/蔗糖酶構建競爭型核酸適體傳感器，并結合血糖儀實現(xiàn)對DH的檢測。結果表明，靶目標孵育時間和蔗糖酶催化時間分別為30 min和120 min；DH的線性檢測范圍為0.45～10 mmol/L，相關系數(shù)為0.997，檢出限為0.45 mmol/L。對該傳感器的準確性和特異性進行實驗驗證，表明該方法具有選擇性好、穩(wěn)定性高、操作簡單的特點，并在環(huán)境監(jiān)測、食品安全的即時檢測方面具有應用前景。目前該方法的檢測范圍還具有一定局限性，這是由血糖儀自身制備工藝所限制，未來可以通過實驗條件的優(yōu)化以及采取合理的信號放大等方法來改善。