基于電子鼻及氣相色譜-質譜聯用技術對川西高原4 種蜂蜜揮發性成分分析

陳廷廷，胡 瓊，唐 潔*，王秀梅，劉 波，陳 林

我國是蜂蜜生產大國，蜂蜜產量占世界蜂蜜產量的1/4以上，川西高原位于青藏高原東南邊緣，該地區環境污染少，日照時間長，晝夜溫差大，蜜源豐富，主要有油菜、白刺、當歸、黃芪等達17 個科屬的植物蜜源[1]。產自高寒山區與高原地帶的川西高原蜂蜜，其蜜質濃稠，營養成分和生物活性成分含量高，除主要的糖類外，還有氨基酸、有機酸、蛋白質、維生素及礦物質等[2]，具有良好的消炎、殺菌和潤膚等醫療保健功能[3]。因此，越來越多地受到消費者的喜愛并被作為無公害純天然的安全食品進行廣泛開發。

近年來蜂蜜市場需求量不斷增大，但國內蜂蜜質量難以保障，蜂蜜品質良莠不齊，不僅有損消費者的利益，對我國蜂蜜的出口創匯能力也有較大影響。而目前僅僅依靠傳統的感官判定方法評價蜂蜜品質往往不夠客觀，因此尋求一種快速、靈敏的檢測方法尤為重要。蜂蜜的揮發性成分對其風味有重要貢獻，分析蜂蜜中的揮發性成分，可以作為鑒別蜂蜜蜜源及品質的一種方法[4]。國內外蜂蜜揮發性成分研究較早，已有超過600 種揮發性物質從不同蜂蜜中鑒別出來[5]，然而，有關川西高原蜂蜜揮發性成分研究報道甚少。且對蜂蜜揮發性成分的檢測主要采用單一檢測方法，如Huang Lingxia等[6]利用電子鼻鑒定了不同蜂蜜的植物來源；Uckun等[7]利用氣相色譜-質譜-嗅聞聯用測定了黃芪和柑橘蜂蜜的芳香活性化合物；涂世等[8]利用氣相色譜-氫火焰化離子檢測和氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）技術對油菜蜂蜜揮發性成分進行分析并建立了油菜單花蜜揮發性成分的指紋圖譜。而通過GC-MS和電子鼻與多變量數據分析區分不同蜜源蜂蜜的研究鮮有報道。

本實驗利用電子鼻系統，對川西高原油菜蜂蜜、當歸藥花蜜、白刺花蜜和山花蜜4 種不同蜜源蜂蜜進行初步區分，再結合頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）與GC-MS檢測不同蜂蜜的揮發性成分，以期探明不同蜜源蜂蜜揮發性成分的差異，并找出4 種蜂蜜特征性揮發成分，旨在為蜂蜜種類鑒別、品質研究以及川西高原蜂蜜的開發應用等提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 蜜源信息Table 1 Information of honeys tested in this study

本實驗的蜂蜜樣品由四川紅草地農業開發有限公司提供，樣品信息見表1。

1.2 儀器與設備

75 μm PDMS/CAR萃取頭 北京康林科技有限公司；SPME手動進樣手柄 上海安譜實驗科技股份有限公司；QP 2010 PLUS GC-MS儀 日本島津公司；PEN3便攜式電子鼻系統 德國Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 電子鼻檢測

準確稱取4.0 g蜂蜜樣品于50 mL螺旋塞樣品瓶中，加蓋密封，50 ℃加熱平衡10 min。電子鼻檢測載氣（合成干燥空氣）流速150 mL/min，數據采集時間150 s，延滯時間300 s，每組6 個平行[9-10]。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS檢測

HS-SPME：將萃取頭于GC進樣口老化30 min，溫度250 ℃。萃取條件為密封狀態60 ℃平衡30 min，插入萃取頭后60 ℃吸附30 min，迅速將萃取頭置于進樣口250 ℃解吸2 min，進行GC-MS分析。

GC條件：DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃，程序升溫：起始溫度40 ℃，保持2 min；4 ℃/min升至80 ℃，保持2 min；10 ℃/min升至160 ℃，保持2 min；5 ℃/min升至200 ℃，保持2 min；20 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。載氣He，流速1.2 mL/min，不分流進樣。

MS條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z 55～500[11-12]。

1.4 數據統計

采用Alpha SOFT V12軟件分別進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）；利用NIST譜庫對揮發性成分進行鑒定，并用峰面積歸一化法確定各種成分的相對含量；利用Origin 8.0軟件進行成分種類統計；用Minitab 16軟件進行特征揮性發物質統計。

2 結果與分析

2.1 電子鼻對蜂蜜揮發性成分分析

2.1.1 PCA方法對4 種蜂蜜的電子鼻分析

4 種蜂蜜揮發性成分PCA結果如圖1所示，數據采集點所在的橢圓區域在PCA圖中有特定的分布區域但又有部分重疊，說明PCA法適用于不同蜂蜜樣品的成分分析。通過PCA得出，第1主成分區分貢獻率為91.90%，第2主成分區分貢獻率為7.13%，2 個主成分累計貢獻率超過99%，表明這2 個主成分代表了樣品的主要信息特征，可用于分析不同蜂蜜中揮發性成分的相關性。油菜蜂蜜與當歸藥花蜜、白刺花蜜與山花蜜兩兩之間有部分重疊，表明它們之間有相似的揮發性成分；油菜蜂蜜、當歸藥花蜜與白刺花蜜、山花蜜之間沒有重疊，表明前兩者與后兩者揮發性成分差別較大。

圖1 4 種蜂蜜揮發性成分PCA圖Fig. 1 Principal component analysis of aroma components in four kinds of honey

2.1.2 LDA方法對4 種蜂蜜的電子鼻分析

4 種蜂蜜的LDA如圖2所示，其判別式LD1和LD2的貢獻率分別為74.20%和16.94%，總貢獻率達91.94%，較好地反映了樣品的總體信息，且4 個蜂蜜品種沒有重疊，說明LDA分析可對4 種蜂蜜進行區分，與Romano等[13]的研究結果一致。從各品種蜂蜜橢圓的距離來看，油菜蜂蜜與其他蜂蜜的距離較大，且在LD1軸上與其他蜂蜜顯著區分，這可能是由于油菜蜂蜜具有不同于其他3 種蜂蜜的特殊揮發性物質，在LDA中被識別。Dymerski等[14]的實驗結果表明LDA是一種能更好地評估蜂蜜植物來源的工具，利用電子鼻結合LDA可以完全區分不同波蘭蜂蜜樣品的類型，本實驗中，相比PCA，LDA對不同蜂蜜電子鼻分析結果較好，LDA技術能夠減少電子鼻響應中觀察到的漂移效應，因此，LDA能提高分類的精度。

圖2 4 種蜂蜜揮發性成分LDA圖Fig. 2 Linear discriminant analysis of aroma components in four kinds of honey

2.2 HS-SPME-GC-MS對蜂蜜揮發性成分分析

2.2.1 4 種蜂蜜揮發性成分總離子流圖及成分統計

電子鼻可以對樣品的整體風味進行分析檢測，能更直觀地反映不同蜜源蜂蜜的相似性，但不能對風味物質的具體種類和含量進行分析[15-16]，為進一步對不同蜂蜜揮發性成分進行測定，采用HS-SPME-GC-MS對油菜蜂蜜、當歸藥花蜜、白刺花蜜和山花蜜4 種蜂蜜揮發性成分進行檢測，結合NIST譜庫聯機檢索，最終分別鑒定出揮發性成分40、51、39 種和46種，采用峰面積歸一化法得到4 種蜂蜜鑒定出的化合物占總易揮發成分總量分別為98.72%、97.23%、95.86%、91.62%，其總離子流色譜圖如圖3所示，可以看出不同蜂蜜揮發性成分相對含量有所不同。

圖3 4 種蜂蜜揮發性成分的總離子色譜圖Fig. 3 Total ion chromatogram of aroma components of four kinds of honey

2.2.2 主要揮發性成分分析

對4 種蜂蜜主要揮發性成分進行統計分析，各主要成分及相對含量見表2。

表2 不同蜜源蜂蜜揮發性成分及相對含量Table 2 Volatile components and relative contents of different kinds of honey

續表2

續表2

由表2可知，4 種川西高原蜂蜜的揮發性成分種類及含量均存在較大差異，從4 種蜂蜜樣品中共檢測出123 種揮發性成分，其中醇類化合物36 種、酯類25 種、酮類13 種、醛類18 種、烴類31 種。對4 種蜂蜜的揮發性成分進行分類統計，如圖4所示，4 種蜂蜜中揮發性成分主要為醇類化合物，分別占總揮發性成分的74.8%、40.8%、71.28%、57.05%，這說明醇類在4 種蜂蜜揮發性成分中起重要作用，同時油菜蜂蜜中的醇類相對含量最高，但酮類物質較少，張麗珍等[17]利用GC-MS檢測到的油菜蜂蜜中醇類物質也最多，特別是乙醇，相對含量最高。當歸藥花蜜含有酯類和酮類物質較多，分別占總揮發性成分的23.00%、15.23%，白刺花蜜和山花蜜含有醛類物質較多，分別占總揮發性成分的13.10%、16.72%，這與前人關于酯類和醛類物質可作為蜂蜜香味主要來源的報道一致[18-19]。檢測到的醛類物質中，糠醛、苯乙醛在油菜蜂蜜、白刺花蜜、山花蜜3 種蜂蜜中被檢出且相對含量較高，研究發現，糠醛、苯乙醛是不同蜂蜜風味最重要的揮發性成分[6]。

4 種不同蜜源蜂蜜檢測到的共有物質有7 種，分別是乙醇、異戊醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、芳樟醇、乙酸乙酯、甲基庚烯酮和右旋萜二烯，其中，芳樟醇、乙酸乙酯、甲基庚烯酮和右旋萜二烯被廣泛應用于食品、醫藥和化工工業[20-21]。右旋萜二烯具有似鮮花的清淡香氣，呈甜橙和柑橘類風味，在栗有志等[22]分析的4 種新疆蜂蜜、張麗珍等[17]分析的3 種江西蜂蜜以及任佳淼[23]分析的18 種寧夏等蜂蜜中均未被檢測出。研究發現，右旋萜二烯具有很好的抗癌活性[24]，對蜂蜜的生物醫學活性具有重要貢獻[25-26]，該活性物質在川西高原蜂蜜中的檢出，可能對川西高原蜂蜜風味的形成和營養價值具有重要的作用。

圖4 4 種蜂蜜揮發性成分種類的相對含量Fig. 4 Relative contents of volatile substance categories in four kinds of honey

運用Minitab 16軟件對4 種蜂蜜的7 種共有揮發性成分進行特征性物質分析，相關矩陣特征值及特征向量如表3所示，由表3可知，前2 個主成分的累計貢獻率為95.8%，第1主成分貢獻率最高，為49.6%，主要綜合了異戊醇、甲基庚烯酮的含量信息；第2主成分貢獻率為46.2%，主要綜合了乙醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇的含量信息。因此，異戊醇、甲基庚烯酮、乙醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇對川西高原蜂蜜的揮發性成分具有重要影響，其含量可用作蜂蜜揮發性成分特點的評價。

表3 特征向量及累計方差貢獻率Table 3 Eigenvectors and cumulative contribution of variance

對4 種蜂蜜共有揮發性物質種類進行統計分析，結果如圖5所示。由圖5可知，白刺花蜜與山花蜜有25 種相同物質，油菜蜂蜜與當歸藥花蜜有12 種相同物質，說明它們之間揮發性成分的相似度較高，與電子鼻PCA結果基本一致。上述結果表明，GC-MS分析和電子鼻聯合PCA、LDA可以成功區分不同來源蜂蜜樣品的揮發性成分。

圖5 4 種蜂蜜共有揮發性成分種類分析Fig. 5 Analysis of volatile components common to four kinds of honey

Alissandrakis等[27]認為當某化合物是某種單花蜜中的特有成分，則此化合物是該單花蜜的特征性揮發物質。研究表明，蜂蜜中的某些揮發性成分可以作為特征組分用以鑒定不同蜜源蜂蜜，在蜂蜜加工中，避免或降低特征風味組分的損失可能會成為工藝改進的一個重要出發點[28]。本研究分析檢測到的油菜蜂蜜、當歸藥花蜜、白刺花蜜、山花蜜4種蜂蜜中特有揮發性成分分別有22、27、26 種和19 種，其中相對含量較多的揮發性成分分別有乙酸異戊酯（具有梨和香蕉的香味）、乙酸丁酯（有愉快果香氣味）、丙烯酸2-乙基己酯、四甘醇，這些化合物分別在4 種蜂蜜揮發性成分中起著重要作用，同時在任佳淼等[29]分析的馬占相思樹蜂蜜、Pattamayutanon等[30]分析的5 種蜂蜜（龍眼、向日葵、咖啡、野花、荔枝）以及Uckun等[7]分析的黃芪蜂蜜和柑橘蜂蜜的揮發性成分中未被檢出或檢出含量較少，因此可以確定這4 種揮發性成分為4 種蜂蜜的特征性揮發組分。

3 結 論

基于PCA、LDA方法的電子鼻檢測能很好地區分川西高原不同蜜源蜂蜜。HS-SPME-GC-MS鑒定出油菜蜂蜜、當歸藥花蜜、白刺花蜜及山花蜜4 種蜂蜜中有7 種共有物質，其中右旋萜二烯對川西高原蜂蜜風味和營養價值具有重要貢獻，異戊醇、甲基庚烯酮、乙醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇含量可用作川西高原蜂蜜揮發性成分特點的評價；特有揮發性成分可以作為特征組分用以鑒定特定蜂蜜的蜜源，川西高原4 種蜂蜜特有揮發性成分分別有22、27、26 種和19 種，其中含量較多的有乙酸異戊酯、乙酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯和四甘醇，可作為4 種蜂蜜的特征性揮發成分。通過電子鼻和GC-MS兩者結合，同時從宏觀和微觀上研究川西高原蜂蜜揮發性成分可為更好地開發和利用蜂蜜資源提供理論依據和技術參考。