桂花多酚類化合物電噴霧萃取電離質譜分析

薛阿輝，崔 萌，鄒華杰，羅麗萍,2,*

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）屬木犀科木犀屬（Osmanthus），是中國特有的常綠闊葉灌木或小喬木經濟樹種。除供觀賞外，其根、花和果實也具有藥用價值[1-2]。桂花還是傳統的食品，富含氨基酸、優質植物蛋白和鐵、鋅等人體必需的微量元素，香濃味甜，營養豐富，被稱為“全營養食品”[3-4]。

目前有關桂花芳香成分的報道較多。研究表明，桂花含有α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、芳樟醇氧化物、芳樟醇、γ-癸酸內酯、二氫-β-紫羅蘭酮、壬醛、（Z）-β-羅勒烯和β-蒎烯等芳香物質[5-7]。從桂花醇提液中鑒定出了苯丙素苷、環烯醚萜苷、苯乙醇苷、木脂素類和酚酸類物質[8-13]?？傮w來看，對桂花多酚類化合物的系統研究相對較少。多酚類化合物是一類廣泛存在于植物中的多羥基酚類化合物，具有良好的抗癌、抗氧化、抗衰老等生物活性，目前的分析方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質譜聯用和核磁共振。

電噴霧萃取電離質譜（extractive electrospray ionization-mass spectrometry，EESI-MS）技術是一種新興的離子化技術，可對復雜基體樣品進行直接快速質譜分析，適用于分析液體、氣溶膠、固體表面和黏性樣品等不同形態的樣品[14]，已應用于蜂蜜中化學污染物[15]、蓮子中生物堿[16]和臍橙中氨基酸、糖類和生物堿[17]等的研究。

為建立桂花中多酚類化合物的EESI-MS分析法，本實驗以四季桂花為實驗材料，首先采用分光光度法測定其總酚、總黃酮含量，在采用HPLC法了解其多酚類化合物組成的基礎上，采用EESI-MS分別在正、負離子模式下分析四季桂花醇提液中的原兒茶酸、p-香豆酸、咖啡酸、表兒茶酸、綠原酸、肉桂酸、桑黃素和楊梅素8 種化合物。研究可為多酚類化合物的分析提供一定數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂花為四季桂，2016年10月采于南昌大學前湖校區。樣品于60 ℃烘干至恒質量，保存于干燥器中備用。

沒食子酸、楊梅素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸、山柰酚、（＋）-兒茶素、p-香豆酸等標準品（純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；肉桂酸、柚皮素、槲皮素等標準品（純度≥98%）中國固體制劑制造技術國家工程研究中心；桑黃素、表兒茶素、木犀草素、原兒茶酸、蘆丁等標準品（純度≥98%） 中國藥品生物制品檢定所；橙皮苷、白藜蘆醇等標準品（純度≥98%） 北京百靈威科技有限公司；無水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）和甲酸（優級純）均為國產市售。

1.2 儀器與設備

Alliance HPLC儀 美國Waters公司；C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、EESI離子源由江西省質譜科學與儀器重點實驗室研制；LTQ-XL線性離子阱質譜儀美國Finnigan公司；FA2204B電子天平 上海精科天美科學儀器有限公司；KQ3200DE型數控超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司；Hitech-Master綜合型超純水機 上海和泰儀器有限公司；TDL-5-A臺式低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 桂花醇提液的制備

參照Tsai等[18]的方法，干燥桂花用研缽研磨成粉后，稱取干粉0.500 g，加入70%甲醇溶液7.5 mL，50 ℃超聲提取30 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，殘渣重復提取1 次，合并上清液，定容至500 mL，獲得四季桂花醇提液。

1.3.2 總酚、總黃酮含量的測定

1.3.2.1 總酚含量的測定

參照文獻[19-21]，以沒食子酸為標準品，采用Folin-Ciocalteu法測定總酚含量。沒食子酸標準曲線繪制：精密稱取干燥至恒質量的沒食子酸，用超純水溶解，配制成質量濃度分別為0.015 6、0.031 3、0.062 5、0.125 0、0.250 0 mg/mL的標準液，分別準確吸取1 mL各質量濃度標準液于25 mL容量瓶中。加入3 mL的Folin-Ciocalteu試劑，再加入2 mL 200 g/L的碳酸鈉溶液，混勻后用蒸餾水定容，70 ℃水浴15 min，室溫冷卻后，于760 nm波長處測定各管吸光度，以吸光度為橫坐標、沒食子酸終質量濃度為縱坐標繪制標準曲線，以沒食子酸空白溶液作對照。

樣品測定：準確吸取20 μL四季桂花醇提液于25 mL容量瓶中，其他步驟同上。通過沒食子酸標準曲線回歸方程計算總酚含量。實驗重復3 次，結果以沒食子酸的質量計，以 ±s表示。

1.3.2.2 總黃酮含量的測定

以蘆丁為標準品，采用鋁鹽顯色法測定總黃酮含量。蘆丁標準曲線繪制：精密稱取干燥至恒質量的蘆丁標準品0.005 0 g于25 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，配成0.2 mg/mL的標準溶液。分別準確吸取0.1、0.2、0.8、1.6、3.2 mL和6.4 mL的標準液于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇至10 mL。各瓶中分別加入100 g/L氯化鋁溶液0.5 mL，混勻后用蒸餾水定容，室溫靜置15 min后，于415 nm波長處測定各管吸光度，以吸光度為縱坐標、蘆丁終質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，以蘆丁空白溶液作對照。

樣品測定：準確吸取待測樣品50 μL于25 mL容量瓶中，其他步驟同上。通過蘆丁標準曲線線性回歸方程計算樣品中總黃酮含量。實驗重復3 次，結果以蘆丁的質量計，以 ±s表示。

1.3.3 HPLC法測定桂花中的15 種多酚類化合物

色譜柱：Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）和0.5%甲酸溶液（B）；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長280 nm和320 nm；進樣量20 μL。采用梯度洗脫[22]：0～5 min：5%～14% A；5～20 min：14%～21% A；20～27 min：21%～27% A；27～40 min：27%～42% A；40～48 min：42%～65% A；48～54 min：65%～35% A；54～60 min：35%～14% A；60～62 min：14%～5% A。

原兒茶酸、（＋）-兒茶素、表兒茶素、桑黃素、槲皮素和柚皮素的混合標準品溶液在280 nm波長下檢測；綠原酸、p-香豆酸、蘆丁、阿魏酸、橙皮苷、楊梅素、白藜蘆醇、肉桂酸和木犀草素的混合標準品溶液在320 nm波長下檢測。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）進行分析，設定參照譜圖，將譜圖自動匹配生成對照圖譜進行相似度評價，依據保留時間及紫外吸收光譜定性；半定量分析根據標準品和樣品的濃度與峰面積之間的比例關系計算。

1.3.4 EESI-MS檢測條件

線性離子阱質譜（line iron trap-mass spectrometry，LTQ-MS）為正、負離子檢測模式，質譜掃描范圍m/z 50～800；離子傳輸管溫度150 ℃；ESI溶劑為甲醇；霧化氣為氮氣（純度99.999%），壓力為1.2 MPa；ESI溶劑和樣品流速分別為4、5 μL/min；兩噴霧口之間的距離0.1 cm，夾角60°，距質譜口0.5 cm，角度為150°；測定時的實驗條件：萃取劑為甲醇，電噴霧電壓3.5 kV，母離子的隔離窗口寬度設定為1.0 Da，碰撞時間為30 ms，碰撞能量17%～25%，其他參數由LTQ-MS軟件系統自動優化[23]。EESI-MS檢測到的化合物定性是通過比對實驗得到的精確質量與Pub Chem數據庫中串聯質譜信息及標準品譜圖確定。

將HPLC檢測的15 種多酚類化合物標準品配制成500 μg/L的混合標準品溶液，分別在正、負離子模式下進行EESI-MS2掃描，選擇m/z 153、163、179、289、353、149、303、319進行碰撞誘導解離實驗，獲得二級質譜圖。

2 結果與分析

2.1 四季桂花總酚、總黃酮含量結果

沒食子酸和蘆丁標準曲線回歸方程分別為：y=116.64x＋0.022 5（R2=0.991 8）；y=29.176x-0.000 3（R2=0.999 5）。四季桂花醇提液中總酚和總黃酮含量分別為（133.38±0.12）mg/g和（72.49±0.09）mg/g。Chen Guanlin等[24]采用超高效液相色譜法測定金盞花中總酚和總黃酮含量分別為（13.03±0.24）mg/g和（3.03±0.08）mg/g；蠟梅中總酚和總黃酮含量分別為（25.77±0.10）mg/g和（5.96±0.11）mg/g；茉莉花中總酚和總黃酮含量分別為（12.66±0.17）mg/g和（3.77±0.06）mg/g。與其他花卉相比，桂花中的總酚和總黃酮含量較高。

2.2 桂花中15 種多酚類化合物的HPLC測定結果

多酚類化合物因結構特征有兩個主要吸收帶，其中一個吸收帶在300～400 nm區間，由B環桂皮酰系統產生，另一個吸收帶在240～285 nm區間，由A環苯甲酰系統產生[25]。在256、280、320 nm三種波長下檢測四季桂花醇提液，發現在280 nm和320 nm波長下出峰數量和分離效果最好。在綜合考慮基線、峰形、信號響應強弱以及負峰等情況后，最終確定將標準品分為2 組，分別在280 nm和320 nm波長處檢測。分組后混合標準品的分離效果較好（圖1）。

圖1 混合標準品在280 nm（a）和320 nm（b）波長的HPLC圖Fig. 1 HPLC profile of mixed standards at 280 nm (a) and 320 nm (b)

圖2 280 nm（a）和320 nm（b）波長下桂花醇提液的HPLC圖Fig. 2 HPLC profiles of methanol extract from O. fragrans flowers at 280 nm (a) and 320 nm (b)

HPLC法從四季桂花中檢測到了15 種多酚類化合物（圖2和表1），總含量為52.438 mg/g。其中含量較高的有楊梅素、桑黃素、蘆丁、柚皮素和（＋）-兒茶素。

表1 四季桂花中15 種多酚類化合物的HPLC測定結果Table 1 Determination of 15 polyphenolic compounds in O. fragrans flowers by HPLC

2.3 四季桂花醇提液EESI-MS分析

圖3 正（a）、負離子（b）下四季桂花醇提液的EESI-MS圖Fig. 3 Extractive electrospray ionization mass spectra of methanol extract of O. fragrans flowers in positive and negative ion modes

四季桂花醇提液的EESI-MS一級譜圖見圖3。混合標準品溶液在正、負離子模式下，選擇m/z 153、163、179、289、353、149、303、319進行碰撞誘導解離實驗，獲得二級質譜圖（圖4）。

負離子模式下對m/z 153、163、179、289、353進行碰撞誘導解離分析。m/z 153的二級譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 109，由母離子丟失一個CO2形成（[M-44]-），與原兒茶酸標準品（圖4a）和文獻[26]中關于原兒茶酸的報道一致，可以確認m/z 153為原兒茶酸；母離子m/z 163的二級譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 119，由母離子丟失一個CO2形成（[M-44]-），與p-香豆酸標準品（圖4b）和文獻[27]報道一致，可以確認m/z 163為p-香豆酸；母離子m/z 179的二級譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 135和m/z 161，是母離子分別丟失一個CO2（[M-44]-）和H2O（[M-18]-）形成，與咖啡酸標準品譜圖（圖4c）和文獻[26]一致，可以確認m/z 179為咖啡酸；母離子m/z 289的二級譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 245，m/z 245是母離子丟失—CH2CHOH—基團形成的碎片峰（[M-44]-），與表兒茶素標準品譜圖（圖4d）和文獻[28]一致，可以確認m/z 289為表兒茶素；母離子m/z 353的二級譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 191，是母離子丟失一個咖啡?；纬傻目崴幔╗M-162]-），m/z 179是母離子丟失一個奎尼酸加一個羥基形成的咖啡酸（[M-174]-），與綠原酸標準品譜圖（圖4e）和文獻[26]一致，可以確認m/z 353為綠原酸。

正離子模式下對m/z 149、303、319進行碰撞誘導解離實驗和定性分析。母離子m/z 149的二級譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 131 ，由母離子丟失一個H2O形成（[M-18]-），這與肉桂酸標準品譜圖（圖4f）一致，可以確認m/z 149為肉桂酸；母離子m/z 303的二級譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 285，由母離子丟失一個H2O形成（[M-18]-），這與桑黃素標準品譜圖（圖4g）和文獻[29-30]報道一致，可以確認m/z 303為桑黃素；母離子m/z 319的二級譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 301，由母離子丟失一個H2O形成（[M-18]-），進一步丟失一個CO2形成m/z 257（[M-62]-），這與楊梅素標準品譜圖（圖4h）一致，可以確認m/z 319為楊梅素。

綜上所述，采用EESI-MS從四季桂花醇提液中鑒定出了原兒茶酸、p-香豆酸、咖啡酸、表兒茶素、綠原酸、肉桂酸、桑黃素和楊梅素8 種多酚類化合物。

圖4 8 種標準品的EESI-MS二級譜圖Fig. 4 EESI-MS2 spectra of 8 standards

3 結 論

四季桂花總酚和總黃酮含量分別為（133.38±0.12）mg/g和（72.49±0.09）mg/g，分別為其干質量的13.34%和7.25%，說明其富含多酚類化合物。采用HPLC從四季桂花醇提液中檢測到了15 種多酚類化合物，其中楊梅素、桑黃素、蘆丁、柚皮素和（＋）-兒茶素含量較為豐富。進一步采用EESI-MS，在未經色譜分離的情況下，負離子模式下直接從四季桂花醇提液中檢測出了原兒茶酸、p-香豆酸、咖啡酸、表兒茶素和綠原酸5 種化合物；正離子模式下檢測出了肉桂酸、桑黃素和楊梅素3 種化合物。EESI-MS具有樣品用量少、不需要色譜分離、分析速度快等優點，可用于多酚類化合物的分析。