馬乳酒樣乳桿菌ZW3基因WANG_1108的特性及功能

王金菊，侯乾宇，楊 迎，耿偉濤，王艷萍*

乳酸菌是革蘭氏陽性細菌，其最終碳水化合物發酵主要產物為乳酸[1]，是一種公認安全的益生菌。乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是乳酸菌生長代謝過程中產生并分泌到胞外的一種天然高分子化合物，分子質量大小通常在4.0×104～6.0×106u之間[2]，具體分為莢膜多糖和黏液多糖[3]。隨著人們對綠色、天然食品的不斷要求，乳酸菌EPS受到廣泛的關注。EPS不僅具有抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6-8]、免疫調節[9]等諸多生物活性，還可以作為天然的發酵劑、增稠劑、穩定劑及乳化劑等[10-11]添加應用到食品中。有報道[12-15]認為乳酸菌之所以具有這些功能與細菌表面上的多糖成分有關。乳酸菌EPS本身具有許多生物活性[13-15]。文獻[16]報道了2 種常用的乳化劑羥甲基纖維素鈉和吐溫80能夠引起小鼠結腸炎和肥胖及代謝綜合癥，為乳化劑的不安全性提供了有力的證據，故依靠菌種自身的發酵特性實現產品的良好性能顯得尤為重要。但乳酸菌EPS合成產量普遍較低[17]，還不能滿足生產的需求，提高EPS產量成為急需解決的問題，因此需要對乳酸菌EPS合成相關的基因和合成途徑進行研究[18-19]，提高EPS的產量，擴大EPS在食品與非食品領域的應用。

乳酸菌EPS合成分為4 個過程：單糖轉運進入細胞質、葡萄糖-1-磷酸的合成、糖的活化和連接聚合以及多糖的輸出[20-21]。其中，葡糖-6-磷酸與葡糖-1-磷酸的相互轉換、UDP-葡萄糖的生產量均涉及核糖核苷酸前體的供給，也是EPS生物合成途徑的重要控制點。由實驗室自行分離得到的馬乳酒樣乳桿菌ZW3（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3）菌種具有良好的產糖特性，優化的EPS產量達到2 000 mg/L以上，且目前已對ZW3全基因組進行了測序[22]，為后續闡明其多糖產量與基因表達的關系奠定了基礎。

本實驗以高產EPS的馬乳酒樣乳桿菌ZW3及產糖量降低的突變株2#為研究對象，通過對突變株基因組重測序以及與野生菌ZW3基因組比對分析出突變基因，并利用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術分析可能與產糖相關的突變基因相對表達量，從中選出基因WANG_1108，構建重組質粒轉至表達菌株大腸桿菌（Escherichia coli）BL21中并分別測定其在野生菌與突變株中的酶活性，初步闡明突變基因與EPS產量的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

馬乳酒樣乳桿菌ZW3、實驗室前期利用Mμ轉座技術獲得的產糖量下降的馬乳酒樣乳桿菌ZW3的突變株2#、表達菌株E. coli BL21（DE3）、質粒pET28a（5 369 bp）均由本實驗室自行分離保存；重組質粒pET28a-ZW3/2#-1108（7 652 bp）由本實驗室自行構建。

1.1.2 培養基

改良MRS培養基：酵母粉45.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉15.0 g，NaCl 0.15 g，半胱氨酸鹽酸鹽1.4 g，磷酸氫二鉀0.5 g，吐溫80 1 g，硫酸錳0.2 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH值至6.2～6.4，115 ℃高壓滅菌20 min。固體培養基需另加入2%瓊脂粉。

2YT培養基：稱取蛋白胨16 g，酵母浸粉10 g，NaCl 5 g，溶解后用蒸餾水定容到1 000 mL，NaOH溶液調節pH值至7.0，121 ℃滅菌20 min。固體培養基再加入2%瓊脂粉。

自誘導培養基：胰蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，丁二酸鈉5.4 g，二水檸檬酸鈉0.3 g，甘油25 mL，葡萄糖0.5 g，α-乳糖 2 g，Na2HPO42.55 g，KH2PO43.4 g，NH4Cl 2.68 g，Na2SO40.71 g，MgSO4·7H2O 0.493 g，FeCl3·6H2O 0.03 g，蒸餾水定容至1 000 mL，115 ℃高壓滅菌20 min。固體培養基需另加入2%瓊脂粉。

1.1.3 試劑

限制性內切酶、T4 DNA連接酶 立陶宛Fermentas公司；蛋白酶K（50 mg/mL）、Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒、cDNA第一條鏈合成試劑盒 康為世紀生物科技有限公司；溶菌酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；MμA轉座酶 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；6×Loading Buffer 天根生化科技（北京）有限公司；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinases，STPKs）酶聯免疫分析試劑盒 上海嵐派生物科技有限公司。

1.1.4 引物

引物均利用軟件Primer Premier 5設計，交由華大基因合成（表1）。

表1 本實驗使用的引物Table 1 Sequences of the primers used in this experiment

1.2 儀器與設備

HFsafe900型超凈工作臺 上海力申科學儀器有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 東聯電子技術開發有限公司；DZKW-C型水浴鍋 河北黃華市航空儀器廠；普通藥物天平 上海精科天平廠；多功能厭氧培養箱 美國GeneScience公司；梯度聚合酶鏈式反應儀、熒光定量PCR儀、Power PAC 3000電泳儀、SmartsoecTM3000型分光光度計、全自動凝膠成像儀美國Bio-Rad公司；YS100生物顯微鏡 日本Nikon公司；DYY-III-6B型穩壓穩流電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌EPS產量的測定

以4%的接種量將野生菌ZW3和轉化子2#的種子液接種到新鮮改良MRS液體培養基中，30 ℃厭氧培養；每56、72、84、96 h取樣，將發酵液100 ℃水浴30 min，4 ℃、8 000 r/min離心15 min除去菌體；取一定體積的上清液裝入透析袋，4 ℃蒸餾水透析（截流量6 000～8 000 Da）直至測定透析的蒸餾水中無糖檢出。利用苯酚-硫酸法測定透析袋內EPS含量，利用標準曲線計算樣品EPS產量。

1.3.2 野生菌株與突變株全基因組比對分析

利用第2代高通量測序技術對突變株2#進行了全基因組重測序；利用Emboss軟件提取菌株基因序列，并將野生菌ZW3與突變株2#全基因組進行比對，查找差異。利用在線軟件Clustalw分析比對堿基序列（http://www.genome.jp/tools/clustalw/）。運用生物軟件網的SMS在線翻譯工具對氨基酸進行了翻譯（http://www.bio-soft.net/），并利用GenBank中的BLAST工具對氨基酸序列進行比對（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。

1.3.3 突變基因的RT-qPCR分析

參考產糖標準曲線，采用Trizol法每24 h提取樣品RNA；利用HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA；以cDNA為模板，利用表1所合成的各對引物驗證引物的特異性及擴增效率，使用的染料為SYBR Green I。利用RT-qPCR對各基因的表達進行測定。RT-qPCR總體系為20 μL，cDNA模板1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，2×qPCR SuperMix 10.0 μL，ddH2O 7 μL；RT-qPCR程序為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，退火30 s（各基因退火溫度參照表1），72 ℃延伸30 s，共進行40 個循環。PCR程序之后立即執行熔解曲線的測定：65～95 ℃，每隔0.5 ℃停留5 s檢測熒光強度。

1.3.4 重組質粒的構建與蛋白表達

為驗證STPKs的活性與EPS產量的相關性，構建重組質粒pET28a-ZW3/2#-1108。以馬乳酒樣乳桿菌ZW3與突變株的基因組為模板，PCR擴增基因片段WANG_1108，基因WANG_1108與質粒pET28a均用限制性內切酶BamHI、HindIII雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下16 ℃過夜連接。將連接體系熱激轉化入已制備好的E. coli DH5α感受態中，形成E. coli DH5α轉化子。在進行PCR和雙酶切驗證之后，送金唯智基因公司測序驗證堿基發生突變情況。

驗證無誤后，將重組質粒以同樣的方法轉至表達菌株E. coli BL21（DE3），利用含有卡那霉素抗性平板篩選轉化子。將轉化子在37 ℃條件下振蕩培養過夜，次日以2%的接種量接種到100 mL新鮮的自誘導液體培養基中，30 ℃、180 r/min過夜培養，同時以含有pET28a質粒的E. coli BL21（DE3）作為對照。

1.3.5 STPKs活性的測定

以1.3.4節的方法過夜誘導蛋白表達，使用STPKs酶聯免疫分析試劑盒進行酶活性測定。向96 孔板中加入試劑盒中提供的標準樣品，按說明書要求依次進行溫育、洗滌、加酶、洗滌、顯色，最終根據450 nm波長處吸光度進行酶活性測定。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌EPS產量

以4%的接種量將野生菌L. kefiranofaciens ZW3和突變株2#的種子液接種到新鮮改良MRS液體培養基中，30 ℃厭氧培養。野生菌株ZW3的EPS產量在培養56 h時達到最高值，為2 080.53 mg/L，突變株2#的EPS產量在培養72 h時達到最高值，為1 230.3 mg/L，同野生菌株相比，EPS產量降低了40%，且時間滯后。

2.2 突變株2#的全基因組測序及與野生菌株ZW3基因組分析比對結果

為深入研究突變株2#產糖量下降且時間滯后的原因，對突變株2#進行基因組重測序，并同野生菌株ZW3全基因組序列進行BLAST比對。通過突變株2#基因組重測序，發現其16S rRNA與野生菌株的16S rRNA相似性為100%。這一結果證實了菌株2#確實為馬乳酒樣乳桿菌ZW3的突變株，并為后續分析突變株2# EPS產量下降的原因與基因突變之間的關系奠定了基礎。

對野生菌株和突變株進行全基因組比對分析發現，在CDS區和啟動子區發生突變的基因共60 個，多糖基因簇并未發生突變，發生突變的基因中相關催化反應酶類有6 個（表2），這6 個基因通過BLAST比對和Pfam數據庫分析預測功能，分別為：WANG_0173、WANG_0174、WANG_0175（WANG_0173、WANG_0175均為編碼二羥丙酮激酶或其亞基部分）、WANG_1108（STPKs）、WANG_0292（β-半乳糖苷酶小亞基）、WANG_0840（UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸連接酶），其中WANG_0292發生了同義突變。

表2 與催化反應相關的突變基因Table 2 Mutant genes associated with catalytic reactions

2.3 與產EPS相關突變基因的RT-qPCR分析結果

2.3.1 RT-qPCR引物特異性及擴增效率

以cDNA為模板，驗證表1所合成引物的特異性，擴增產物如圖1所示，8 個擴增產物均為單一條帶，且片段大小與設計的大小相符，也不存在引物二聚體。實驗分析表明所設計的引物具有良好特異性。

圖1 RT-qPCR產物Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of RT-qPCR product

分析定量時一般取內參循環值15～35。為正確評估PCR擴增效率，至少做5 個數量級倍數連續梯度稀釋模板濃度。當R2值大于0.99時，2 個數值之間相關的可信度很好。由表3可知，標準曲線斜率與PCR擴增效率分別在-3.5～-3、90%～120%范圍內。以野生菌ZW3和突變株2#的cDNA為模板，進行10 倍比稀釋，稀釋系列為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，繪制各基因的標準曲線，結果表明線性關系良好。

表3 RT-qPCR引物的相關參數Table 3 Related parameters with different primers

2.3.2 突變基因RT-qPCR分析結果

RT-qPCR是指在PCR體系中加入熒光基團，通過熒光信號累計實時監測整個PCR進程，利用標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[23]，分為絕對定量與相對定量，其中在研究中應用更為廣泛的為相對定量分析方法[24]。相對定量分析方法是比較2 個或2 個以上樣本中某個基因表達量的變化，關注的是基因的相對表達量。2-ΔΔCt方法是相對定量分析中最經典的方法[25]。

以野生菌ZW3和突變株2#各時間點的cDNA為模板，進行RT-qPCR實驗，采用的染料為目前最常用的能與雙鏈DNA小溝部位結合、具有綠色激發波長的SYBR Green I染料。通過對數據進行統計學分析，得出5 個突變基因在不同時間的相對表達量，結果如圖2所示。

圖2 各基因在不同時間的相對表達量Fig. 2 Relative expression level of each gene at different times

由圖2可以看出，5 個基因相對表達量累加值從小到大順序為WANG_0174＜WANG_0840＜WANG_1108＜WANG_0175＜WANG_0173。在72 h時，各基因的相對表達量均達到最低，尤其WANG_0174相對表達量僅為1%，其他基因中最大的表達量也僅為26%。

WANG_0173、WANG_0174、WANG_0175均為編碼二羥丙酮激酶或其亞基部分，由圖2可以看出，其中WANG_0173、WANG_0175在各時間點基因相對表達量趨勢大體一致，而WANG_0174除了在48 h時相對表達量為113%，其余4 個時間點相對表達量均不到60%，尤其在72 h時相對表達量僅為1%。

由圖2d、e可以看出，WANG_0840與WANG_1108除了在120 h相對表達量等于或大于對照組，其余4 個時間點表達量均下調，但是在72 h時，WANG_1108相對表達量小于WANG_0840。結合上述基因組分析比較結果，WANG_1108 STPKs可以使蛋白質氨基酸殘基發生磷酸化，從而影響酶的結構和催化活性，在EPS合成代謝途經中有著關鍵作用，因此，選取該基因進一步闡明與EPS產量的關系。

2.4 重組質粒pET28a-ZW3/2#-1108的構建結果

2.4.1 擴增基因片段

從野生菌ZW3與其突變株2#中提取染色體DNA，以此作為模板，擴增這2 株菌的基因WANG_1108片段，由圖3可知，得到與表1中對應大小的條帶。

圖3 ZW3/2#-1108 PCR產物Fig. 3 PCR products of ZW3/2#-1108

2.4.2 重組質粒驗證結果

重組質粒大小為7 652 bp，利用熱激轉化的方法將連接體系轉入E. coli DH5α中，37 ℃倒置培養24 h，利用含有卡那霉素抗性的平板篩選轉化子。挑取轉化子進行菌落PCR驗證，并提取質粒進行雙酶切驗證，結果如圖4所示。

圖4 雙酶切驗證圖Fig. 4 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

由圖4可知，酶切目的條帶均在對應大小位置處，且測序結果表明構建的質粒與原基因相似度為100%。

2.5 重組蛋白的誘導表達及酶活性測定結果

2.5.1 重組質粒轉至表達菌株E. coli BL21（DE3）

將重組質粒pET28a-ZW3/2#-1108轉到表達菌株E. coli BL21（DE3）中，挑取轉化子進行PCR驗證，如圖5所示，部分泳道在2 000 bp附近有條帶出現，表明重組質粒轉化成功。

圖5 WANG_1108轉化子PCR驗證圖Fig. 5 PCR identification of WANG_1108 transformants

2.5.2 重組子蛋白的誘導表達及STPKs活性測定結果

2.5.2.1 重組子蛋白的誘導表達

在有利于pET系列重組質粒表達的自誘導培養基中將轉化子進行蛋白表達，經過氨基酸序列基本理化特性分析得到：基因WANG_1108蛋白分子質量大小為87.7 kDa，且不具有信號肽。所以通過離心收集菌體重新懸浮破碎檢測上清液來判斷蛋白是否表達。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，在大約87 kDa處檢測到WANG_1108編碼的蛋白條帶（圖6）。

圖6 蛋白表達十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Fig. 6 SDS-PAGE analysis of the expressed protein

2.5.2.2 STPKs活性測定結果

按照1.3.6節方法，以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，得到標準曲線方程為y=0.012 5x＋0.038 7，R2為0.995。

本實驗所用的雙抗體夾心酶聯免疫分析具有較高的靈敏度，通過測定，野生菌株ZW3中的STPKs活性為0.223 U/mL，突變株2#為0.14 U/mL，酶活性比野生菌株降低了37%，STPKs的活性減弱，會使EPS產量降低。可能的原因是菌株整體磷酸化水平降低，與多糖合成的相關酶類如糖原磷酸化酶活性減弱。

3 結 論

本研究以西藏kefir粒中分離得到的高產EPS的馬乳酒樣乳桿菌ZW3為研究對象。首先用苯酚-硫酸法對野生菌株與低產糖量突變株進行EPS產量的測定，發現突變株2#的EPS產量最高值為1 230.3 mg/L，產量比野生菌株降低了40%。經全基因組比對分析發現6 個編碼相關催化反應酶類的基因發生了突變，分別為：WANG_0173、WANG_0174、WANG_0175（3個基因均編碼二羥丙酮激酶亞基部分）、WANG_1108（STPKs）、WANG_0292（β-半乳糖苷酶小亞基）、WANG_0840（UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸連接酶），其中WANG_0292發生了同義突變。通過分析二羥丙酮激酶、STPKs和UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸連接酶在代謝通路中的作用，發現這3 個酶可能會影響EPS產量發生變化。

首先，二羥丙酮激酶參與甘油的代謝，具有磷酸化的作用，且具有磷酸烯醇式丙酮酸-甘油磷酸轉移酶的活性[26-28]。該酶可以催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸的反應，進入糖酵解的最后一步，參與糖酵解的過程，糖酵解過程中的生成物又可以通過糖異生途徑再次生成葡萄糖，影響了EPS前體物質UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖的合成，進而會影響了EPS的合成。

其次，STPKs可以使蛋白質氨基酸羥基磷酸化，影響酶的結構和催化活性，在各方面發揮重要作用[29-31]。比如：糖原磷酸化酶催化糖原分解成葡萄糖-1-磷酸，但是糖原磷酸化酶分為2 種，一種是高活力磷酸化酶a，另一種是低活力磷酸化酶b，磷酸化酶a由2 個亞基構成，每個亞基上有一個特定的羥基通過STPKs作用被磷酸化，促進糖原磷酸化酶發揮最大活性。另一個和糖原合成有關的酶，糖原合酶（b），是糖原合成的限速酶，其被STPKs磷酸化后，活性和糖原磷酸化酶相反，活性會被抑制。由以上分析可知，如果STPKs發生突變，活性減弱或消失，隨之糖原磷酸化酶不能被磷酸化，糖原分解受阻，糖原分解產物葡萄糖-1-磷酸含量減少，進而UDP-葡萄糖合成量減少。而糖原合酶與糖原磷酸化酶正相反，其未被磷酸化后，活性增加，促進糖原合成，糖原合成底物UDP-葡萄糖含量減少。綜合以上分析，如果STPKs發生突變活性減弱或消失，作為EPS合成的前體物質UDP-葡萄糖合成量會下降，EPS產量也會隨著降低。

最后，細胞壁對EPS產量也會起到一定作用。在革蘭氏陽性細菌的細胞壁組成成分中，肽聚糖占主導地位[32]。肽聚糖的合成過程分為：合成N-乙酰胞壁酸五肽（“Park”核苷酸）；雙糖肽亞單位的形成；雙糖肽交聯形成肽聚糖。其中UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸連接酶作用于肽聚糖單體合成的第1步，催化D-谷氨酸與UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸的連接[33]。通過對肽聚糖單體合成的影響進而影響細胞壁的合成，而細胞壁對菌體有保護、支持以及協助細胞分裂等重要作用，所以，菌體的生長及一些生理功能也會受到影響。

由以上分析可知，二羥丙酮激酶、STPKs、UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸連接酶分別通過參與糖酵解過程、糖原合成與分解中糖原磷酸化酶與糖原合酶的磷酸化、細胞壁合成影響調控EPS的產量。

通過RT-qPCR分析突變基因相對表達量，發現各基因的相對表達量均有不同程度的下降，選取變化較顯著的WANG_1108基因對其進行生物信息學分析，構建重組表達載體pET28a-ZW3/2#-1108并構建E. coli表達菌株，進一步闡明與EPS產量的關系。誘導表達檢測酶活性發現，突變株中STPKs活性比野生菌降低了37%，表明編碼STPKs的基因WANG_1108的突變與EPS產量的降低有一定的關系。