不同油脂體結構及性質的差異

周 鑫，韓宛君，李東飛，崔春利，江連洲，侯俊財*

油料作物是植物油脂和蛋白質的重要來源[1]，油料加工業銜接了農業、工業與服務業的發展，一直是我國優先發展產業[2]。因此，提高植物油料產品轉化率和加工利用水平，開發以植物油料油脂、蛋白質資源為基質的良好理化特性產品，對延伸農業產業鏈，促進農業增效，打造綠色經濟具有現實意義和深遠影響。

大豆、花生、葵花籽是我國主要的油料作物，也是食用油脂的主要來源[3]。大豆中含有脂肪15%～20%，其中80%為不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA），亞油酸質量分數高達50%，且磷脂含量豐富；大豆中含有高達40%的蛋白質，大約是其他植物的1～6 倍[4]。大豆油脂是多種保健食用油以及高級化妝品所用原料，大豆蛋白也已廣泛用于兒童和保健食品等生產[5]。大豆產品與養殖、醫藥和食品等生產密切相關[6]。花生脂肪質量分數約為45%～60%，其UFA高達80%以上，并含有豐富的磷脂和VE[7]；花生中含有24%～36%的蛋白質，氨基酸比例均衡[8]。在我國，榨油占花生總消費利用的50%～60%，而深加工用量只占10%[9]。葵花籽脂肪質量分數在45%～60%之間，UFA高達85%以上，其中油酸占38%、亞油酸占55%左右[10]，VE含量比例均衡，易被人體吸收，其油脂在國際上被視為優質油脂[11]。葵花籽中含有21%～31%的蛋白質，其分離蛋白具有較好的起泡和乳化性質[12]，開發潛力很大[13]。目前，葵花籽在我國主要消費方式是榨油，高附加值、深加工產品較少。

油脂體是油料作物種子中儲藏脂肪的重要器官，由中性脂類、環繞中性脂的磷脂和嵌插在磷脂層中的蛋白質組成[14]。油脂體因其獨特的結構和組成，且易提取、較穩定的特性，可作為天然健康的油脂-蛋白結合體應用于食品、醫藥、飼料以及化妝品等領域[15]，也可利用油脂體蛋白質表達系統生產外源蛋白質，市場前景廣闊[16]。因此，關于油脂體組成和結構分析及功能開發已成為研究焦點，但目前關于系統性地比較不同油料作物之間油脂體結構及性質差異的研究鮮有報道。且不同油料作物來源油脂體的組成、結構及理化穩定性存在差異，而這些差異會影響其功能性和利用率。基于此，本實驗以大豆、花生和葵花籽源油脂體為研究對象，對其種子及油脂體的顯微結構進行比較，分析了不同源油脂體性質差異，為擴大油脂體在食品工業應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生、葵花籽 市售；大豆（東農52 號）由東北農業大學大豆研究所提供；化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HK-02萬能粉碎機 廣州鴻興機械有限公司；Zetasizer Nano ZS Zeta電位分析儀 英國馬爾文公司；L8800氨基酸自動分析儀、JEM-1200EX透射電子顯微鏡日本日立公司；PowerpacTMBasic型電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 油脂體的制備

大豆、花生和葵花籽油脂體的提取步驟參照崔春利等[17]的方法。種子經蒸餾水浸泡約12 h后，以含0.4 mol/L蔗糖、0.5 mol/L氯化鈉、0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液為研磨介質用組織搗碎機研磨。將勻漿物過濾，獲得濾液，接著以10 000 r/min離心30 min，收集上層乳狀物懸浮在0.1%吐溫20中，分裝于離心管，等量的0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液置于離心桶上層后離心；收集乳狀物懸浮于9 mol/L尿素中，室溫下在振蕩器上振蕩10 min后分裝于離心管中離心；重復上述過程2 次，收集上層乳狀物，即得到油脂體（在上述提取過程中Tris-HCl緩沖液的pH值均為7.5）。

1.3.2 透射電子顯微鏡觀察

大豆、花生和葵花籽種子分別制作超薄切片并在2.5%戊二醛溶液（pH 6.8）中固定6～8 h，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2）沖洗后，于2%鋨酸溶液中固定2 h，隨后經PBS多次漂洗，丙酮梯度脫水，Epon 812環氧樹脂包埋和鈾、鉛雙重染色。采用JEM-1200EX透射電子顯微鏡對超薄切片進行觀察。

1.3.3 油脂體光學顯微觀察

新鮮油脂體均勻溶解于去離子水中，取一滴乳液于載玻片上，蓋上蓋玻片（濾紙吸取多余乳液），在光學顯微鏡下用×100的油鏡觀察并拍照。

1.3.4 蛋白含量的測定

參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法[18]。

1.3.5 脂肪含量的測定

參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法[19]，抽提溶劑為無水乙醚。

1.3.6 氨基酸含量的測定

參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》方法[20]。將油料作物種子干燥、研磨、過篩；新鮮油脂體凍干。準確稱取50 mg處理樣品至水解管中，加入10 mL HCl溶液（6 mol/L），N2吹1 min，封管；水解管于（110±0.5）℃烘箱中水解22～24 h，冷卻至室溫；水解樣品過濾至50 mL容量瓶中，水解管及濾紙經純水洗滌3 次；收集合并濾液，定容。準確量取1 mL濾液，于60 ℃條件下真空脫酸濃縮，加入等量緩沖液并均勻混合，經0.2～0.45 μm濾膜過濾至測樣瓶中（500～1 000 μL）上機測試。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

油脂體的SDS-PAGE分析參照Nikiforidis等[21]的方法，并加以改進。SDS-PAGE分離膠為13%，濃縮膠為5%。油脂體乳液（1 mg/mL）經6.25 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（2% SDS、10%甘油、0.1%溴苯酚藍、5%β-巰基乙醇）處理，煮沸5 min，并進行兩次凍融循環，經離心分離得到含有油脂體蛋白質（3～4 mg/mL）的下層清液，對該清液進行SDS-PAGE。電泳凝膠采用0.25%考馬斯亮藍（R250）進行染色，CH3OH/CH3COOH溶液脫色。

1.3.8 Zeta電位和平均粒徑的測定

油脂體Zeta電位和平均粒徑的測定參照Iwanaga等[22]的方法。1 g新鮮油脂體，均勻懸浮于39 g Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L，pH 7.0）中，懸浮液于室溫條件下存儲24 h后，進行Zeta電位和平均粒徑的測定。

1.3.8.1 Zeta電位的測定

將油脂體懸浮液稀釋至0.005%，用Zetasizer Nano ZS Zeta電位分析儀進行Zeta電位的測定。

1.3.8.2 平均粒徑的測定

油脂體懸浮液稀釋至合適的濃度，采用Mastersizer 2000激光粒度儀進行平均粒徑的測定。

1.3.9 乳化性質的測定

油脂體乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性（emulsifying stability index，ESI）的測定參照Pearce等[23]的方法并加以改進。4 mL樣品稀釋液與1 mL大豆油均勻混合，10 000 r/min均質1 min，分別取200 μL靜置0 min及10 min時的底部乳化液，加入到10 mL 1% SDS溶液中，充分混勻，使用UV-6100紫外分光光度計于500 nm波長處測定吸光度。

EAI和ESI計算公式如下：

式中：A500nm為波長500 nm處時的吸光度；c為蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為油相所占的體積分數（φ=1/5）；A10為靜置10 min后乳狀液吸光度；A0為靜置0 min后乳狀液吸光度；n為稀釋倍數50 倍。

1.3.10 圓二色性（circular dichroism，CD）光譜測定

油脂體蛋白質二級結構分析參照王辰等[24]的方法，將油脂體蛋白質配制成一定質量濃度的蛋白溶液，0.25 mL SDS（1 mol/L）加入到0.5 mL蛋白溶液中，充分混合，再加入9.25 mL蒸餾水，混合均勻，同時配制空白溶液。CD光譜掃描范圍為240～180 nm，溫度25 ℃，速率100 nm/min，光程0.1 nm，靈敏度100 mdeg/cm。油脂體蛋白質二級結構含量參照Reed等[25]的方法進行計算。

CD光譜各峰指認依據為：α-螺旋結構在192 nm附近有一正譜帶，208 nm和222 nm波長處有兩個負峰；β-折疊在216 nm波長處附近有一負譜帶，185～200 nm有一正譜帶；β-轉角在206 nm左右有一正譜帶[26]。

1.4 統計分析

所有實驗均平行3 次，采用SPSS Statistix 17.0軟件進行數據分析，用LSD 0.05進行平均數之間顯著性差異分析，P小于0.05表示差異顯著，采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同油料作物種子細胞微觀結構

大豆、花生和葵花籽種子細胞微觀結構見圖1。成熟的油料作物種子細胞中含有大量灰色蛋白體和白色油脂體，小的油脂體緊密圍繞在較大體積的蛋白體周圍，油脂體外層清晰包裹著邊界膜。大豆種子細胞中蛋白體較多、體積較大，油脂體數量多且分布均勻，直徑分布在0.1～2.0 μm之間，多數呈球形或者橢球形；花生種子細胞內蛋白體相對較少，油脂體間排列相對緊密，大體積油脂體較多，直徑分布在0.3～4.0 μm，且多數呈橢球形或不規則形狀；葵花籽種子細胞中蛋白體積較小，油脂體分布密集，直徑分布在0.3～3.0 μm，大多呈不規則狀，這與Hu Zhiyong等[27]的結果相一致。

圖1 大豆、花生和葵花籽種子超微結構Fig. 1 Ultrastructures of soybean, peanut, and sunflower seeds

2.2 不同油料作物油脂體離體微觀結構

圖2 大豆、花生和葵花籽油脂體高倍顯微觀察（×100）Fig. 2 Microscopic observation of soybean, peanut and sunflower oil bodies (× 100)

由圖2可見，油脂體經過緩沖溶液提取后，可均勻分散于水介質中，且仍能保持結構完整性和獨立性。不同油料作物來源油脂體大小差異較大，同一油料來源油脂體大小也不相同。由高倍顯微鏡圖像可以看出，花生油脂體體積最大，大豆油脂體體積最小。研究顯示，油脂體體積與油脂體膜蛋白體積的大小以及表達量相關，而油脂體膜蛋白組分的多元化可能是導致同一來源油脂體體積大小不同[28]。

2.3 不同油料作物油脂體組成成分

2.3.1 不同油料作物油脂體基本組成

表1 大豆、花生和葵花籽油脂體組成成分Table 1 Chemical compositions of soybean, peanut and sunflower oil bodies%

由表1可見，大豆油脂體蛋白質含量顯著高于花生和葵花籽油脂體（P＜0.05），而脂肪含量則顯著低于后兩者（P＜0.05）；大豆油脂體中蛋白質與脂肪比例（0.086∶1）顯著高于花生油脂體（0.018∶1）和葵花籽油脂體（0.028∶1）（P＜0.05）；油脂體中蛋白質和脂肪的比例與種子中蛋白質和脂肪的比例呈正相關關系，油脂體的蛋白質含量與脂肪含量呈負相關[29]；3 種油脂體的蛋白質含量均低于種子蛋白質含量，而脂肪含量則相反。說明油脂體在提取過程中，保留了種子中的大部分脂肪，而絕大部分的外源蛋白質則被去除[30]。不同油料作物油脂體的基本組成含量之間存在差異，這與油脂體種子來源中的蛋白含量有關[31]。Tzen等[14]的研究結果顯示，油脂體的大小主要由三酰甘油酯與蛋白質的比例決定，油脂體蛋白（尤其是Oleosin蛋白）含量越高的物種，油脂體體積越小，與本研究結果一致。

2.3.2 不同油料作物種子及油脂體的氨基酸組成

注：疏水性氨基酸指Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe和Pro的總量。同行數據肩標字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。表3同。

表2顯示，大豆種子中總氨基酸含量、疏水氨基酸總量以及測得的17 種氨基酸含量均顯著高于花生和葵花籽種子（P＜0.05）；葵花籽種子中Thr、Met、Ile含量顯著高于花生種子（P＜0.05）。3 種油料種子中Glu含量最高，其次是Asp。大豆、花生和葵花籽種子中疏水氨基酸總量占總氨基酸百分比分別為36.76%、34.39%和36.80%。

由表3可見，除了Tyr、His和Arg以外，大豆油脂體中其余氨基酸含量、總氨基酸含量和疏水氨基酸總量均顯著高于花生油脂體和葵花籽油脂體（P＜0.05）；葵花籽油脂體中Asp、Glu、Leu、Lys、His和Pro含量均顯著高于花生油脂體（P＜0.05），其他氨基酸含量間無顯著性差異（P＞0.05）。大豆、花生和葵花籽油脂體中含量最高的氨基酸分別為Val、Tyr和Glu。大豆油脂體中極性氨基酸Glu、Asp和Thr等含量顯著高于花生油脂體和葵花籽油脂體（P＜0.05），而花生油脂體中極性氨基酸含量最低。3 種油脂體中疏水性氨基酸總量占總氨基酸含量的比例分別為55.81%、64.29%和52.23%。大豆油脂體中Glu、Asp和Thr以及疏水氨基酸總量均顯著高于花生油脂體和葵花籽油脂體（P＜0.05）。

3 種油料作物油脂體中氨基酸總量均遠低于種子中氨基酸總量，且大豆油脂體中Glu、Asp和Thr酸以及疏水氨基酸總量均顯著高于花生和葵花籽油脂體（P＜0.05），這與其含有較高含量的蛋白質有關。

注：疏水性氨基酸指Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe和Pro的總量。同行肩標字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

2.4 不同油料作物油脂體SDS-PAGE圖譜

圖3 大豆、花生和葵花籽油脂體蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE profiles of proteins in soybean, peanut and sunflower oil bodies

由圖3可見，3 種油脂體蛋白質組成存在差異，大豆和葵花籽油脂體蛋白質均存在多條譜帶。大豆油脂體蛋白質分子質量主要分布在15～30 kDa和35～50 kDa之間，花生油脂體蛋白質分子質量大多分布在15～25 kDa和30～37 kDa之間，葵花籽油脂體蛋白質分子質量主要分布于15～25、35～45 kDa以及50～75 kDa之間。大豆油脂體蛋白質中Oleosin蛋白分子質量大約在17、18 kDa和24 kDa左右，花生和葵花籽油脂體蛋白質只含有17 kDa和18 kDa Oleosin蛋白，大豆油脂體蛋白質中Oleosin含量明顯高于花生和葵花籽油脂體蛋白質；大豆和葵花籽油脂體中均含有Caleosin蛋白（25～35 kDa）和Steroleosin 蛋白（39～41 kDa），而花生油脂體在39～41 kDa之間并未出現明顯條帶圖譜。此外，大豆和葵花籽油脂體中攜帶的貯存蛋白較多。

油脂體表面的鑲嵌蛋白主要分為3 類：Oleosin蛋白（15～26 kDa）、Caleosin蛋白（27 kDa）和Steroleosin族蛋白（39～41 kDa），高于41 kDa的蛋白質一般為外源蛋白質（即貯存蛋白）[32]。本研究SDS-PAGE圖譜顯示，大豆、花生和葵花籽油脂體中均含有Oleosin蛋白，且大豆油脂體蛋白質中Oleosin含量顯著高于花生和葵花籽油脂體蛋白質（P＜0.05）；大豆和葵花籽油脂體中還含有Caleosin蛋白和Steroleosin蛋白，而花生油脂體電泳圖譜中并未出現明顯的Steroleosin蛋白條帶；3 種油脂體中均存在貯存蛋白質；花生油脂體更為純凈。Nikiforidis等[33]的研究結果表明，油脂體在提取過程中不僅含其自身結構油脂體蛋白質，而且還攜帶有多種外源性蛋白質，而外源蛋白質的存在，同樣影響其穩定性[34]。油脂體在提取及清洗過程中，不同來源蛋白質受提取條件及清洗劑的影響不同，且油脂體攜帶的外源蛋白質因其來源不同而有差異，這是導致3 種油脂體中蛋白組成差異的主要原因。

2.5 不同油料作物油脂體Zeta電位和粒徑分布

圖4 大豆、花生和葵花籽油脂體Zeta電位Fig. 4 Zeta potential of soybean, peanut and sunflower oil bodies

由圖4可見，大豆油脂體的Zeta電位為（－36.53±0.57）mV，顯著高于花生油脂體（－26.6±0.66）mV和葵花籽油脂體（－34.5±1.09）mV（P＜0.05）。Zeta電位可以反映乳液體系中乳滴的表面電荷和乳滴之間相互作用力的大小，Zeta電位（正或負）越高，體系越穩定，乳滴之間越不易凝結或聚集[35]。油脂體中的Oleosin蛋白帶正電的區域與帶負電的磷脂及游離脂肪酸通過鹽橋相連，而負電基團則裸露在油脂體表面，因此油脂體整體帶負電[14]。在中性環境下，大豆油脂體的Zeta電位顯著高于花生和葵花籽油脂體（P＜0.05）。不同油料作物來源的油脂體表面蛋白質種類和含量有差異，且氨基酸組成也不相同，這可能是導致3 種油料作物油脂體表面電荷量差別較大的主要原因[36]。

圖5 大豆、花生和葵花籽油脂體粒徑分布Fig. 5 Particle-size distribution profiles of soybean, peanut and sunflower oil bodies

油脂體粒徑分布見圖5，3 種油脂體粒徑均呈單峰分布狀態。大豆油脂體的粒徑多分布在0.3～2.3 μm，體積平均粒徑D[4,3]為0.93 μm；花生油脂體的粒徑分布相對較寬，多集中在0.6～6.3 μm，D[4,3]為2.58 μm；葵花籽油脂體的粒徑分布多集中于0.4～3.27 μm，D[4,3]為1.64 μm。3 種油脂體在離體條件下的粒徑大于其在種子細胞內的粒徑。

2.6 不同油料作物油脂體乳化性質

圖6 大豆、花生和葵花籽油脂體EAI及ESIFig. 6 EAI and ESI of soybean, peanut and sunflower oil bodies

由圖6可見，大豆、花生和葵花籽油脂體的EAI分別為（61.59±1.11）、（55.77±1.83）m2/g和（50.86±1.61）m2/g。其中，大豆油脂體的EAI顯著高于花生和葵花籽油脂體（P＜0.05），而花生油脂體的ESI（13.39±0.04）min）則顯著高于大豆和葵花籽油脂體（（12.00±0.09）min和（10.93±0.08） min）（P＜0.05），葵花籽油脂體的EAI和ESI均最低。

3 種油脂體中，大豆油脂體的EAI最高，可能是由于大豆油脂體中較高的蛋白含量和疏水性氨基酸總量增加了油脂體的界面膜厚度，提高了界面強度[24]，使得單位質量的大豆油脂體能夠乳化更多體積的油脂。花生油脂體具有較好的ESI可能是由油脂體蛋白質的結構和分子內無序結構含量不同、舒展狀態一致、疏水區域裸露情況有差異導致的。油脂體蛋白質分子中無序結構越多，吸附在油脂體表面的疏水基團就越多，這在一定程度上能夠維持其ESI[37]。

2.7 不同油料作物油脂體蛋白質CD光譜分析

本實驗采用240～180 nm遠紫外光譜測定油脂體蛋白質的CD譜，結果如圖7所示。在測定波長區域內，3 種油料作物油脂體均在波長190～200 nm之間出現正譜帶，在193 nm附近出現正峰，而在208 nm和222 nm附近出現單一負峰。

圖7 大豆、花生和葵花籽油脂體蛋白質CD光譜Fig. 7 CD spectra of proteins in soybean, peanut and sunflower oil bodies

表4 大豆、花生和葵花籽油脂體蛋白質二級結構組成Table 4 Secondary structure composition of proteins in soybean,peanut and sunflower oil bodies

由表4可知，大豆油脂體蛋白質α-螺旋結構含量為（43.58±0.12）%，顯著高于花生（35.43±0.06）%和葵花籽油脂體蛋白質（37.00±0.09）%（P＜0.05）；花生油脂體蛋白質的無規則卷曲含量顯著高于大豆和葵花籽油脂體蛋白質（P＜0.05）；而葵花籽油脂體β-折疊（（25.50±0.11）%）和β-轉角結構含量（（19.00±0.07）%）均顯著高于大豆（23.45±0.05）%、（8.55±0.04）%和花生油脂體蛋白質（（22.55±0.02）%、（16.90±0.15）%）（P＜0.05）。3 種油料作物油脂體蛋白質二級結構間存在差異，但均以α-螺旋結構含量為最高。與Tzen等[38]油脂體蛋白質組成及結構的研究結果一致。大豆油脂體中α-螺旋結構含量顯著高于花生和葵花籽油脂體（P＜0.05），花生油脂體中蛋白質的無規則卷曲含量顯著高于大豆和葵花籽油脂體蛋白質（P＜0.05）。這說明，大豆油脂體蛋白質的分子結構更為緊密，而花生油脂體蛋白質的分子結構相對疏松，肽鏈更加舒展，這有利于其內部疏水基團的暴露及表面蛋白膜的形成[39]，這可能是花生油脂體ESI較高的原因之一。

3 結 論

本實驗結果表明，不同油料作物來源油脂體具有相似的組成和結構；大豆油脂體中蛋白質和脂肪比例（0.086∶1）顯著高于花生（0.018∶1）和葵花籽油脂體（0.028∶1）（P＜0.05），而平均粒徑（（0.93±0.07） μm）卻顯著低于花生（（2.58±0.06）μm）和葵花籽油脂體（（1.64±0.03）μm）（P＜0.05）；大豆油脂體疏水氨基酸總量最高，花生油脂體疏水氨基酸總量最低大豆油脂體Zeta電位、乳化穩定性以及EAI均顯著高于花生和葵花籽油脂體（P＜0.05）；大豆油脂體蛋白質α-螺旋結構含量（（43.58±0.12）%）顯著高于花生（（35.43±0.06）%）和葵花籽油脂體蛋白質（（37.00%±0.09）%）（P＜0.05）；而花生油脂體蛋白質的β-折疊和無規則卷曲含量最高。本研究比較了大豆、花生和葵花籽種子及油脂體組成成分的差異和油脂體的性質，為其在以后的加工生產中提供了理論支持。