濕熱條件下大豆分離蛋白與葡萄糖、麥芽糖的美拉德反應

王魯慧，肖軍霞，徐同成，王 鵬，黃國清,*

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）主要由清蛋白和球蛋白組成，蛋白質含量在90%以上[1]，含有多種必需氨基酸及豐富的不飽和脂肪酸、鈣、磷、鐵、膳食纖維等[2]。

作為少數幾種可以與動物性蛋白相提并論的植物源蛋白之一，SPI在食品工業中占有重要地位，但由于其溶解性、乳化性和起泡性等功能性質較差，在一定程度上限制了應用，因此對其進行改性具有重要的實際應用價值。改性是指利用生化和/或物理因素使蛋白質的氨基酸殘基和多肽鏈發生某種變化，引起蛋白大分子空間結構和理化性質改變，從而獲得較好的功能特性和營養特性[3]。SPI的改性方法分為物理改性、化學改性、酶法改性和基因工程改性[4-7]。

糖基化能有效改善SPI的功能性質，美拉德反應是實現蛋白質糖基化的一種重要途徑[8-9]。美拉德反應由于安全性高、條件溫和及操作簡單等特點，在SPI的改性中具有很大的應用潛力。例如，曾永昶等[10]通過對SPI的糖基化改性延長了其貯藏期；布冠好等[11]通過對SPI進行糖基化改性降低了抗原性和致敏性；于莉萍等[12]研究用美拉德反應提高SPI凝膠性的工藝條件，使得SPI的凝膠性顯著提高；Hernández-García等[13]表明與葡萄糖（glucose，Glu）的美拉德反應可改善血漿蛋白和雞蛋清的乳化性能；Chen Xiumin[14]和Morales[15]等通過對SPI進行糖基化改性提升了抗氧化性。在這些報導中多是有針對性的對某些性質如溶解性、乳化性和抗氧化性等進行研究，卻未對SPI美拉德反應產物進行更加深入的表征。

本實驗擬在濕熱條件下使SPI與Glu、麥芽糖（maltose，Mal）發生美拉德反應，研究各條件對美拉德反應程度的影響，并對所得產物的部分性質進行表征。旨在為美拉德反應在SPI改性中的實際應用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（食品級） 青島天新食品添加劑有限公司；Glu（分析純） 天津市鼎盛鑫化工有限公司；Mal（分析純） 上海市笛柏化學品技術有限公司；金龍魚精煉大豆油（食品級） 盛達食品有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、乙酸、甲醇、95%乙醇溶液、磷酸、丙三醇（均為分析純）萊陽市康德化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、考馬斯亮藍G250、雙丙烯酰胺（均為分析純），牛血清白蛋白（生化試劑） 天津市巴斯夫化工有限公司；丙烯酰胺（化學純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Mr-90恒溫磁力攪拌器 上海瀘西分析儀器廠有限公司；DL-5-B低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；T18高速分散儀 德國IKA公司；ZEN3690 Nano ZS90納米粒度及ζ電勢儀 英國馬爾文實驗設備公司；MS104TS分析天平、Delta320 pH計、TGA 2-SF熱重分析儀 瑞士梅特勒-托利多儀器公司；FDU-1200真空冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司；UV-2000紫外分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；F-2700熒光分光光度計 日本日立公司；DYY-12電腦三恒多用電泳儀北京六一儀器廠；ST5凝膠成像儀 法國Vilber Lourmat公司；NicoletIR200傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反應條件的優化

1.3.1.1 反應溫度對美拉德反應的影響

準確稱取8 g SPI，按質量比4∶1加入2 g Glu或Mal，用190 mL蒸餾水溶解，使SPI質量分數達到4%。用NaOH溶液調節反應體系pH值至9.0，分別置于40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴條件下反應4 h后，冷卻至25 ℃，3 000 r/min離心15 min，測定美拉德反應發生的程度。

1.3.1.2 反應時間對美拉德反應的影響

準確稱取8 g SPI，按質量比4∶1加入2 g Glu或Mal，用190 mL蒸餾水溶解，使SPI質量分數達到4%。用NaOH溶液調節反應體系pH值至9.0，置于80 ℃水浴條件下分別反應2、4、6、8、10 h后，冷卻至25 ℃，3 000 r/min離心15 min，測定美拉德反應發生的程度。

1.3.1.3 混合比例對美拉德反應的影響

準確稱取4 g SPI，按質量比4∶4、4∶2、4∶1.5、4∶1、4∶0.5分別加入Glu或Mal，用蒸餾水溶解，使SPI質量分數達到4%。用NaOH溶液調節反應體系pH值至9.0，置于80 ℃水浴條件下反應4 h后，冷卻至25 ℃，3 000 r/min離心15 min，測定美拉德反應發生的程度。

1.3.2 美拉德反應程度的檢測

美拉德反應中間產物在波長290 nm處具有特征性吸收，最終產物在波長420 nm處具有特征性吸收[14]，因此可用波長290 nm和420 nm處的吸光度表示美拉德反應的程度。取離心后的上清液分別在上述2 個波長處測定吸光度，以蒸餾水作為對照。

1.3.3 美拉德反應產物的表征

將天然SPI（SPI-N），加熱后的SPI（SPI-H），還原糖（Glu、Mal）與SPI的簡單混合物（SPI-Glu-Mix、SPIMal-Mix）以及它們在優化條件下制備的美拉德反應產物（SPI-Glu-MRPs、SPI-Mal-MRPs）放入-18 ℃條件下冷凍48 h，再將其放入真空冷凍干燥機中凍干，研磨成均勻的粉末待用。

1.3.3.1 溶解度測定

采用考馬斯亮藍G250染色法[16]。取6 支10 mL的帶塞試管，分別加入1 000 μg/mL的牛血清白蛋白溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL后補足蒸餾水到1 mL，從而得到0～500 μg/mL的牛血清白蛋白稀釋溶液，取各質量濃度的稀釋液0.1 mL分別加入5 mL 100 μg/mL的考馬斯亮藍G250溶液，旋渦振蕩混勻，靜置2 min，于波長595 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。

參照上述方法，測定溶液中可溶性蛋白的質量濃度，溶解度用每毫升水溶液中溶解蛋白質的微克數來表示[17]。分別取美拉德反應產物10 mL，3 000 r/min離心15 min，取1 mL上清液稀釋10 倍，加入5 mL 100 μg/mL考馬斯亮藍G250溶液，旋渦振蕩混勻，靜置2 min。以考馬斯亮藍G250溶液調零，于波長595 nm處測定吸光度，根據標準曲線計算SPI溶解度。

1.3.3.2 乳化活性測定

分別取一定體積一定質量濃度的美拉德反應產物，加入1/3體積的大豆色拉油，10 000 r/min高速攪拌5 min后，取1 mL乳化液加入79 mL蒸餾水稀釋，另取1 mL稀釋液與9 mL 1 g/L的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液混合均勻，以1 g/L的SDS為空白，于波長500 nm處測定吸光度。SPI的乳化活性按下式計算[18]：

式中：T為2.303；A為波長500 nm處乳化液的吸光度；N為稀釋倍數；C為乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為乳化液中油相的體積分數/%。

1.3.3.3 ζ電勢測定

取美拉德反應產物的上清液1 mL，用去離子水按1∶10稀釋，渦旋振蕩，利用ZEN3690 Nano ZS90納米粒度及ζ電勢儀測定ζ電勢，測試溫度25 ℃，平行測定3 次。

1.3.3.4 溶液pH值的測定

分別將美拉德反應產物在3 000 r/min離心15 min后，取上清液測定pH值。

1.3.3.5 熱穩定性測定

取凍干后的樣品粉末0.003 0 g左右，分別加入熱重分析儀樣品盒中，以空白作為對照，氮氣為保護氣，以10 ℃/min的速率從30 ℃加熱到500 ℃，記錄加熱過程中的熱曲線。

1.3.3.6 紅外光譜分析

取少量凍干后的樣品粉末于瑪瑙研缽中，加入一定量KBr進行研磨，將研磨好的粉末壓片。將壓片置于紅外光譜儀在4 000～400 cm-1進行掃描分析，空白KBr作為背景對照。

1.3.3.7 熒光光譜分析

取凍干后的樣品粉末，根據所測得的溶解度用pH 7.0、50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至溶液中蛋白質量濃度達到1 mg/mL，激發波長為334 nm，狹縫寬度5 nm，在波長350～500 nm進行檢測。

1.3.3.8 SDS-PAGE分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測美拉德反應對SPI組分的影響。

取凍干后的樣品粉末0.015 g，加入超純水，渦旋振蕩使其完全溶解，10 000 r/min離心10 min。取上清液200 μL加入染色劑染色，在沸水中煮沸5 min，冷卻至室溫，10 000 r/min離心10 min。用進樣針取10 μL依次加入到膠板的樣品道中，設置電壓200 V，電流50 mA。結束后將膠板取出，加入脫色液脫色至適宜顏色，凝膠成像系統拍照分析。

1.4 數據處理

每種樣品每次均測定3 個平行，結果以 ±s表示，采用SPSS 17.0進行統計分析。組間差異顯著性分析采用方差分析（ANOVA）中的Tukey HSD測試，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 美拉德反應條件的優化

2.1.1 反應溫度對美拉德反應的影響

圖1 反應溫度對SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）吸光度的影響Fig. 1 Effect of reaction temperature on the absorbance of SPI-Glu-MRPs (A) and SPI-Mal-MRPs (B)

由圖1A可知，隨著溫度的升高，SPI-Glu-MRPs的A290nm和A420nm都呈增加的趨勢，且A290nm和A420nm均在100 ℃時達到最大值，表明Glu與SPI發生了美拉德反應。由圖1B可知，隨著溫度的升高，SPI-Mal-MRPs的A290nm和A420nm也基本呈增大趨勢，在100 ℃時A290nm達到最大，但A420nm在90 ℃時最大，100 ℃時顯著降低（P＜0.05），這可能是由于美拉德反應程度過高，形成了大量不溶性的高級反應產物所致[19]。綜合比較，除100 ℃外，SPI-Glu-MRPs的A290nm和A420nm均高于SPI-Mal-MRPs，表明Glu比Mal更易于與SPI發生美拉德反應。這可能是由于Glu的分子質量要小于Mal，因此空間位阻更小，更易于與SPI中的反應位點接觸[20-21]。考慮到當美拉德反應程度過高時會產生不溶性的聚合物，本實驗選擇80 ℃作為反應溫度進行后續研究。

2.1.2 反應時間對美拉德反應的影響

圖2 反應時間對SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）吸光度的影響Fig. 2 Effect of reaction time on the absorbance of SPI-Glu-MRPs (A)and SPI-Mal-MRPs (B)

由圖2A可知，SPI-Glu-MRPs的A290nm隨著反應時間的延長呈現先升高后降低的變化趨勢，并在6 h時達到最大；相應SPI-Glu-MRPs的A420nm隨著反應時間的延長而緩慢升高，6 h后差異不顯著（P＞0.05），表明美拉德反應逐漸進入到高級階段，且在6 h時美拉德反應程度較完全。由圖2B可知，反應時間對SPI和Mal美拉德反應的影響規律基本與Glu一致，即隨著反應時間的延長，A290nm先升高后降低，A420nm緩慢增加。綜合考慮美拉德反應發生的程度、反應產物的溶解性以及能耗問題，最終選取反應時間6 h進行后續研究。

2.1.3 混合比例對美拉德反應的影響

由圖3A可知，在SPI比例保持不變的情況下，隨著Glu比例的減少，SPI-Glu-MRPs的A290nm隨之顯著降低（P＜0.05），A420nm也基本呈現出了類似的趨勢。然而，混合質量比對SPI與Mal美拉德反應的影響要小很多。由圖3B可知，隨著反應體系中Mal含量的減少，雖然A290nm也隨之降低，但是降低幅度遠小于SPI-Glu-MRPs，這同樣可能是由于Glu和Mal分子結構不同造成的。Glu分子更小，在溶液中的遷移速率更快，因此其比例的變化比SPI與Mal美拉德反應的影響更大。考慮到改性應當以SPI為主體，從經濟的角度出發，選擇SPI與Glu/Mal混合質量比4∶1繼續進行研究。

圖3 混合質量比對SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）吸光度的影響Fig. 3 Effect of mass ratio between SPI and sugar on the absorbance of SPI-Glu-MRPs (A) and SPI-Mal-MRPs (B)

2.2 美拉德反應產物的表征

2.2.1 溶解性測定結果

圖4 與Glu和Mal的美拉德反應對SPI溶解性的影響Fig. 4 Effect of Maillard reaction with glucose and maltose on the solubility of SPI

當反應時間為2 h和6 h時，SPI-Mal-MRPs和SPI-Glu-MRPs的溶解性均隨著反應時間的延長而增加，且前者的溶解性要高于后者，但是均高于在相同條件下加熱的SPI-H；當反應時間進一步延長至10 h時，2 種美拉德反應產物的溶解性均顯著降低（P＜0.05），其中SPI-Glu-MRPs的溶解性甚至低于SPI-H，這表明當反應時間過長時形成了不溶于水的大分子聚合物，美拉德反應進入了高級階段，且Glu更易于與SPI形成此類產物。這與圖2中6 h后美拉德反應產物A290nm開始降低及A420nm開始升高的趨勢一致。因此，與Glu和Mal適度的美拉德反應可以顯著提高SPI的溶解性，在與羧甲基纖維素鈉[22]和麥芽糊精[23]的美拉德反應產物中也觀察到了相同的結果。

2.2.2 乳化活性測定結果

與多糖發生美拉德反應是提升蛋白質乳化活性的重要手段[24]，干熱法是最常用于提升SPI乳化活性的方法，已有文獻表明干熱條件下與羧甲基纖維素鈉[22]、麥芽糊精[23,25]和Glu[26]的美拉德反應可以顯著提升SPI的乳化活性，但是關于濕熱條件下美拉德反應對SPI相關功能性質的影響還比較少見。

圖5 與Glu和Mal的美拉德反應對SPI乳化性的影響Fig. 5 Effect of Maillard reaction with glucose and maltose on the emulsifying activity of SPI

由圖5可知，相同條件下SPI-H的乳化活性最高，加入還原糖會降低SPI-H的乳化活性，這可能是SPI與大豆油形成的乳狀液的穩定結構被加入的還原糖破壞所致[25]。濕熱條件下加熱6 h后，SPI-H及2 種美拉德反應產物的乳化活性均隨之降低，且SPI-Glu-MRPs的乳化活性略高于SPI-Mal-MRPs，但是仍低于SPI-H，這與上述干熱條件下得到的美拉德反應產物乳化活性的變化規律相反。表明濕熱法和干熱法對SPI功能性質具有不同的影響。這可能是由于在干熱狀態下，美拉德反應主要發生在SPI分子表面，而在濕熱狀態下，SPI、Glu和Mal均處于伸展狀態，因此接觸更加充分，反應更加充分，使得SPI的結構發生了改變，降低了其在油水兩相界面的吸附作用，使得SPI的乳化活性降低[27]；同時，美拉德反應產物溶解性增加意味著疏水性氨基酸含量降低[28-29]，這進一步影響了美拉德反應產物在油水界面的吸附作用，導致SPI的乳化活性降低。

2.2.3 美拉德反應產物溶液的pH值測定結果

由圖6可知，與Glu和Mal發生美拉德反應6 h使SPI溶液的pH值由8.9降低至7.2和7.6。研究表明，SPI中參與美拉德反應的氨基酸主要是賴氨酸和精氨酸[23]，在濕熱條件下，這2 種堿性氨基酸更容易參與美拉德反應；同時，美拉德反應會生成酸性物質，這導致了SPI溶液pH值的降低。

圖6 與Glu和Mal的美拉德反應對SPI溶液pH值的影響Fig. 6 Effect of Maillard reaction with glucose and maltose on the pH of SPI solution

2.2.4 美拉德反應產物的ζ電勢測定結果

圖7 與Glu和Mal的美拉德反應對SPI溶液ζ電勢的影響Fig. 7 Effect of Maillard reaction with glucose and maltose on the ζ potential of SPI solution

當反應時間為2 h時，SPI-Glu-MRPs和SPI-Mal-MRPs溶液的電勢與SPI-H相比差異較小，但當反應時間延長至6 h時，2 種產物的ζ電勢迅速降低，這可能是由于SPI中大量—NH2參與了美拉德反應，質子化程度降低，導致美拉德反應產物負電荷含量增加，由圖6可知，在反應時間為6 h時美拉德反應產物溶液的pH值降低，這一溶液pH值與ζ電勢的關系同張夢雪等[30]的測定結果一致；但是當反應時間進一步延長至10 h時，SPI-Glu-MRPs和SPIMal-MRPs溶液的ζ電勢又開始增加，且高于SPI-H，這與Li Weiwei等[31]在SPI水解物與Glu和Mal美拉德反應產物中得到的結果一致。這些結果表明，在一定反應程度下Mal和Glu結合同樣可以改變SPI表面電荷的分布且美拉德反應程度高會增強靜電屏蔽作用[32]；另外，在整個反應時間范圍內，SPI-Glu-MRPs的ζ電勢均高于SPI-Mal-MRPs。由于SPI的電荷特性對其在微囊化、溶液中的穩定性等性質有重要影響[23]，因此可通過選擇合適的還原糖種類或反應時間來獲得具有所需電荷特性的改性SPI。

2.2.5 美拉德反應產物的熱穩定性

如圖8所示，變化速率明顯分為3 個階段，分別為第1階段60～200 ℃、第2階段200～300 ℃、第3階段300～500 ℃。在60～200 ℃范圍內，SPI-Glu-MRPs（圖8A）和SPI-Mal-MRPs（圖8B）的熱量損失與SPI-N和SPI-H相比均較小。該溫度范圍內的熱量損失通常是由于水分蒸發所致，水分蒸發減少表明美拉德反應可能導致了大分子質量產物的形成，使其持水能力增強[4]；在200～300 ℃范圍內，美拉德反應產物的質量損失率急劇增加，這表明美拉德反應產生了一些易于分解或易于揮發的物質，這些物質在該溫度范圍內發生了分解或揮發，從而導致質量急劇下降[24,33]；在300～500 ℃范圍內，美拉德反應產物進一步發生分解。這說明美拉德反應會適當降低SPI的熱穩定性。

圖8 SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）的熱重分析圖譜Fig. 8 DTG patterns of SPI-Glu-MRPs (A) and SPI-Mal-MRPs (B)

2.2.6 美拉德反應產物的傅里葉變換紅外光譜分析

圖9 SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）的紅外光譜圖Fig. 9 FTIR spectra of SPI-Glu-MRPs (A) and SPI-Mal-MRPs (B)

如圖9所示，3 441 cm-1處的吸收峰為—NH2＋的伸縮振動峰，在SPI-Glu-MRPs（圖9A）和SPI-Mal-MRPs（圖9B）均出現了該峰，表明該基團并未完全參與美拉德反應；但是在SPI-Glu-MRPs中與SPI-H相比峰變寬，表明發生的美拉德反應對該基團產生了一定的影響；1 650 cm-1對應乙酰胺基CH3—O＝C—NH—中的—CO—的伸縮振動，與SPI-H相比，2 種反應產物的峰也變寬，表明SPI與2 種糖發生了美拉德反應。

2.2.7 美拉德反應產物的熒光強度分析

圖10 SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）的熒光光譜圖Fig. 10 Fluorescence spectra of SPI-Glu-MRPs (A) and SPI-Mal-MRPs (B)

熒光強度可以作為美拉德反應程度的一個指標，當美拉德反應進入到高級階段時即會形成熒光物質[34]。由圖10可知，2 種美拉德反應產物在400～425 nm波長處均具有特征吸收，且吸收均強于相應的單體及簡單混合物，這與在酪蛋白和乳清蛋白同Mal或乳糖形成的美拉德反應產物中觀察到的結果一致[35]，表明SPI與還原糖發生了美拉德反應；通過比較還可以看出，SPI-Glu-MRPs的熒光強度比SPI-Mal-MRPs強，表明Glu更易于與SPI發生美拉德反應，這與圖1中觀察到的結果一致。

2.2.8 美拉德反應產物的SDS-PAGE分析

圖11 SPI-Glu-MRPs和SPI-Mal-MRPs的SDS-PAGE圖譜Fig. 11 SDS-PAGE patterns of SPI-Glu-MRPs and SPI-Mal-MRPs

由圖11可以看出，SPI-H比SPI-N條帶數少，具體表現為11S組分中對應于蛋白分子質量43 kDa的條帶、7S組分中對應于22 kDa的條帶消失，推斷可能是加熱使得SPI變性和聚集所致；與SPI-Mal-Mix（條帶2）和SPI-Glu-Mix（條帶4）相比，SPI與Mal（條帶1）和Glu（條帶3）發生美拉德反應后在高分子質量處出現了明顯的條帶，11S組分有2 個條帶顏色變淺，同時與SPI-H相比66.2 kDa的條帶消失，這證實了SPI與Mal和Glu發生了美拉德反應并形成了高分子聚合物。

3 結 論

分別對Glu、Mal與SPI的美拉德反應條件進行優化，研究發現，反應溫度越高，時間越長，美拉德反應程度越高。綜合考慮能源消耗問題，確定美拉德反應表征的研究條件為SPI與Glu/Mal混合質量比4∶1、反應溫度80 ℃、反應時間6 h。

美拉德反應明顯改善了SPI的溶解度，并且Mal比Glu對SPI的改性效果更佳；美拉德反應降低了SPI的乳化性，這與干熱條件下的大部分報導結論相反，表明干熱和濕熱條件下SPI與糖的美拉德反應進程可能有所不同；美拉德反應對SPI的ζ電勢有一定影響，隨著美拉德反應程度的增加，SPI的負電荷明顯減少；美拉德反應會使SPI溶液的pH值降低；熱穩定性分析表明美拉德反應降低了SPI的熱穩定性；傅里葉變換紅外光譜分析表明美拉德反應在SPI中引入了新的化學鍵；熒光分析表明美拉德反應增強了SPI的熒光強度；SDS-PAGE表明美拉德反應導致了大分子的形成。

綜上所述，SPI與還原糖在濕熱條件下的美拉德反應對SPI的溶解性有一定的改善作用，并可通過反應程度來調節產物的ζ電勢。SPI作為食品工業中最為重要的植物性蛋白源，其改性產物在實際應用中具有廣泛的應用前景。