脂聯素對老齡小鼠心肌炎癥因子TNF-α、IL-6表達及左心室舒張功能的影響

李 潔 安 麗 任利群

(東南大學附屬中大醫院老年科，江蘇 南京 210009)

隨著人口老齡化的發展，左心室射血分數正常心衰(HFpEF)的發病率顯著上升，60歲以上老年人的平均發病率為36.0%〔1〕。血漿脂聯素(APN)是脂肪細胞分泌的一種細胞因子，具有改善胰島素敏感性、保護血管內皮、抗動脈粥樣硬化和抗炎特性〔2〕。研究表明，高血壓患者血漿APN水平與左心室肥厚程度呈負相關〔3〕。來自美國〔4〕、日本〔5〕的一系列研究結果均顯示健康百歲或更年老的老年人APN水平較95歲以下或70歲以下者明顯增加，推測APN可能與衰老相關的心臟功能密切相關。本研究擬應用APN基因敲除老齡小鼠動物模型，探討APN對于老齡小鼠心肌炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6表達及左心室功能的影響。

1 材料和方法

1.1動物及分組 APN基因敲除小鼠及野生小鼠由Jackson Laboratory公司提供，均為 C57BL/6J 種系，雄性，每組10只，青年組2月齡，老齡組18月齡。

1.2主要試劑 APN酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒購自美國Biovision公司，Prime Script TM RT regent Kit購自美國Qiagen公司，Trizol、PCR引物購自美國Invitrogen公司。

1.3超聲心動圖檢查 各組小鼠稱重后用10%(3 ml/kg)水合氯醛進行腹腔麻醉，心前區備皮，采用30 MHz探頭的Vevo770高分辨超聲影像系統，選取左心室長軸切面、左心室乳頭肌水平短軸切面及心尖四腔切面，在二維、M型、二尖瓣血流頻譜多普勒、組織多普勒(TDI)下測定以下參數：左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室射血分數(LVEF)、短軸縮短分數(FS)、二尖瓣舒張早期血流速度(E)、二尖瓣舒張晚期血流速度(A)、二尖瓣環舒張早期運動速度(E′)、二尖瓣環舒張晚期運動速度(A′)。每個值取3個連續心動周期測量的均值。

1.4血流動力學指標檢測 各組用10%(3 ml/kg)水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，經右頸動脈插管至左心，用BL-410多功能監護儀監測血流動力學變化，即左心室收縮末壓(LVESP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、收縮末期壓力-容積關系(ESPVR)、舒張末期壓力-容積關系(EDPVR)及Tau指數。測量后開胸，取血，生化自動分析儀測定各組血糖、血脂水平，留取心室組織液氮中保存備用。

1.5ELISA檢測 用ELISA測定血清中APN的含量，操作按試劑盒說明書要求進行。

1.6實時逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測心肌組織中TNF-α、IL-6 表達 Trizol法提取總RNA，并將RNA反轉錄為cDNA。小鼠TNF-α引物：5′-CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG GAG-3′，5′-CAC CAG CTG GTT ATC TCT CAG CTC-3′；小鼠IL-6引物：5′-TTC CAA TGC TCT CCT AAC AG-3′，5′-CTAGGTTTGCCGAGTAGATC-3′；GAPDH引物：5′-AAA GGG CAT CCT GGG CTA CA-3′，5′-CAG TGT TGG GGG CTG AGT TG-3′。PCR反應體積5 μl，其中包括Power SYBR Green PCR Master Mix(2×)2.5 μl，超純水1.25 μl，上下游引物各0.125 μl及稀釋的cDNA 1 μl。每組設3個復孔，以GAPDH作為內參照，PCR反應條件為：預變性95℃3 min，94℃45 s，62℃30 s，72℃60 s，目的基因循環32次，內參照循環27次，結束循環后再延伸72℃10 min，以目的基因與GAPDH比值進行定量分析。

1.7統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組生化指標及血清APN水平 青年APN基因敲除鼠組(QAPNKO組)血清APN水平<0.05 μg/ml，其血糖、TC、TG水平與青年野生小鼠組(QWT組)相比差異無統計學意義；老齡野生小鼠組(LWT組)與青年野生小鼠組(QWT組)相比，血清APN水平明顯增高(F=7.33，P<0.05)，血糖、TC、TG水平增加，但差異無統計學意義；老齡APN基因敲除鼠組(LAPNKO組)血清APN水平<0.05 μg/ml，與老齡野生小鼠組(LWT組)相比，其血糖、TC、TG、低密度脂蛋白(LDL)水平明顯增高(F值分別為264.27，254.42，22.88，70.84，均P<0.05)，見表1。

表1 各組體重、血糖、血脂及血清APN水平

與QWT組相比:1)P<0.05；與QAPNKO組相比:2)P<0.05；與 LWT組相比:3)P<0.05；下表同

2.2各組心肌TNF-α，IL-6基因表達 LAPNKO組與LWT組相比，心肌炎癥指標TNF-α，IL-6 基因表達明顯增高(F值分別為4 502.20，6 252.79，均P<0.05)，見表2。

2.3各組心臟超聲心動圖參數 與LWT組相比，LAPNKO組LVEF及左室FS差異無統計學意義(F值分別為3.05，3.95，均P>0.05)，但LAPNKO組E′/A′較LWT組明顯減低(F=14.7，P<0.05)；E/E′明顯增加(F=24.0，P<0.05)，見表3。

2.4各組血流動力學參數 LAPNKO組與LWT組比較EDPVR及Tau指數均顯著增高(F值分別為56.83，271.06，均P<0.05)，見表4。

表2 各組心肌炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達水平

表3 各組心臟結構與功能指標

表4 各組血流動力學參數

3 討 論

隨著增齡而出現機體器官老化，心肌衰老以心臟結構和功能的變化為主要特征。研究表明，脂肪細胞功能與增齡相關的心血管和代謝性疾病密切相關，提示脂肪細胞因子可能影響機體的衰老過程〔6〕。APN是脂肪細胞分泌的一種有益的細胞因子，參與調節機體能量代謝，研究表明，APN可通過腺苷酸活化蛋白酶(AMPK)及環氧化酶(COX)-2抗炎途徑抑制心肌細胞和成纖維細胞的凋亡及炎癥反應〔7〕。本研究結果提示老齡野生小鼠左心室舒張功能減低。APN缺乏可誘發衰老過程的血糖血脂代謝紊亂，加速心肌衰老過程的炎癥反應，對于老齡左室舒張功能不全的發病具有重要意義。研究發現，老年慢性心力衰竭患者血清APN水平越高，LVEF越低，心衰患者預后越差〔8〕，與本研究結果不一致，可能與其入選的研究對象為左心室射血分數下降心衰(HFrEF)患者有關，另外，病理條件下機體可能存在某種反饋機制影響血清APN水平。APN調控衰老相關的HFpEF分子機制有待進一步研究。