轉化生長因子-β信號通路抑制劑對胚胎干細胞定向分化的影響

劉 浩 趙 燕 張 曉 張念平

(濟南市第三人民醫院，山東 濟南 250032)

胚胎干細胞(ESCs)具有很強的自我更新能力和增殖分化能力，是細胞移植治療神經退行性疾病和脊髓損傷比較理想的細胞來源〔1，2〕。對神經細胞移植來說，應盡可能獲得足夠數量的、均一的神經細胞亞型，避免雜細胞污染。雖然已經發現許多關鍵細胞因子〔如成纖維細胞生長因子(FGF)、單羧酸轉運體(MCT)8、音猬因子(SHH)和空通氣孔同源框(EMX)2等〕與ESCs的神經分化相關〔3〕，但目前的誘導方法仍不能使所有的ESCs分化為神經類細胞〔4，5〕。轉化生長因子(TGF)-β通過控制一系列細胞生理進程(如細胞增殖、遷移、凋亡等)來影響生物體穩態平衡及多個器官和系統的發育〔6〕。近年來有大量文獻報道TGF-β信號通路在ESCs的多能性維持、自我更新能力維持及細胞命運決定等方面發揮重要作用〔7～9〕。本實驗在文獻報道的神經誘導方法的基礎上，聯合使用兩種TGF-β抑制劑對ESCs進行誘導分化，探討TGF-β信號通路在ESCs向神經干細胞(NSCs)分化過程中的作用，并觀察ESCs來源的NSCs向神經細胞分化的能力。

1 材料和方法

1.1小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)制備 取妊娠13.5 d的小鼠，脫臼處死后置于75%酒精中浸泡5 min。剖腹后取出子宮，用含1%雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次。取出胎鼠并去除頭尾、四肢和內臟，將剩余組織用PBS洗3次。以剪刀剪碎組織，加入0.25%的胰酶(碧云天公司，中國)消化3～5 min，MEF培養基終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入MEF培養基吹打均勻后移入10 cm培養皿，2～3 d傳代一次。取第3～4代細胞，以10 μg/ml的絲裂霉素C(Sigma-Aldrich公司，美國)處理備用。MEF培養基：89%達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)高糖(Gibco公司，美國)、10%胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，中國)、1%雙抗(碧云天公司，中國)。

1.2ESCs培養 將經絲裂霉素C處理的MEF細胞按3×104/cm2密度接種至0.1%明膠包被的培養皿上，使用MEF培養基培養，24 h后細胞完全貼壁鋪展開。將小鼠ESCs細胞(R1)接種在MEF細胞上，以ESCs培養基培養，每天換液。每2～3 d將ESCs細胞連同MEF細胞以0.05%的胰酶消化，再以1.5×104/cm2的密度接種至新的MEF細胞上。ESCs培養基：82%DMEM高糖、15%胎牛血清(FBS，Serana公司，德國)、1% 非必需氨基酸(Gibco公司，美國)、0.1 mmol/L 2-巰基乙醇(廣東翁江化學試劑有限公司，中國)、2 mmol/L L-谷氨酰胺(Gibco公司，美國)、1 000 U/ml LIF(leukemia inhibitory Factor，PeproTech公司，美國)、1% 雙抗(碧云天公司，中國)。

1.3ESCs的定向分化 ESCs向NSCs誘導分化參考Ying等〔10〕的單層分化方法：將ESCs連同MEF消化后，差速貼壁兩次(每次30 min)，以去除MEF細胞。收集未貼壁的ESCs細胞，以(0.5～1.5)×104/cm2的密度種到0.1%明膠包被的培養皿中，使用N2B27培養基培養。其中實驗組培養基中加TGF-β抑制劑：1 μmol/L的A83-01(MedChemExpress公司，美國)和100 μg/L的Noggin(R&D Systems公司，美國)，對照組不加。每2 d換液一次，培養9 d即可獲得NSCs。ESCs來源的NSCs向神經細胞分化：將實驗組和對照組來源的NSCs以(2～3)×104/cm2的密度種到多聚-D-賴氨酸包被的培養皿中，以分化培養基培養7 d。ESCs來源的NSCs向多巴胺(DA)能神經元誘導分化參照文獻報道的方法〔4，10〕。N2B27培養基：DMEM/F12培養基中加入0.5%的N2和1%的B27(Thermo Fisher Scientific公司，美國)。分化培養基：N2B27培養基中加入0.2 mmol/L的L-抗壞血酸(Sigma-Aldrich公司，美國)，20 ng/ml的腦源性神經營養因子(BDNF，R&D Systems公司，美國)與1 μmol/L的環磷酸腺苷(南京奧多福尼生物科技有限公司，中國)。

1.4免疫熒光染色 吸棄培養皿中的培養基，PBS洗一次。4%的多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，每次5 min。吸棄上清，加5%～10%的牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min。吸棄BSA后直接加一抗4℃過夜。第2天取出，室溫孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。加入熒光二抗(博士德公司，中國)，室溫孵育1～2 h，PBS洗3次，每次5 min。加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)染色15 min，PBS洗3次，每次5 min。以甘油緩沖液封片，在熒光顯微鏡下觀察。一抗分別為Nestin(Santa Cruz公司，美國)、β-tubulinⅢ(CST公司，美國)、微管相關蛋白(MAP)2(Abcam公司，英國)、酪氨酸羥化酶(TH)(CST公司，美國)。

1.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 以Trizol法提取總RNA，測OD值定量RNA濃度，純度和質量好的RNA樣品OD260/OD280比值應在1.9～2.1。將mRNA逆轉錄成cDNA，選β-actin為內參基因，用熒光定量試劑盒(大連TakaRa公司，中國)在ABI7500熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR反應(相關引物見表1)。結果分析使用比較閾值法來檢測目的基因的相對表達量，相對表達量計算公式：RQ=2-△△CT，其中 △△CT=(CT實驗組目的基因-CT實驗組內參基因)-(CT對照組目的基因-CT對照組內參基因)。

表1 qRT-PCR所需引物及其序列

1.6細胞形態學觀察和計數 熒光染色以后，從至少3次獨立的分化實驗中隨機選擇10個視野，分別對各個熒光下的細胞進行拍照，雙標的需要用Image-pro plus6.0軟件對圖像進行疊加處理。DAPI核染色陽性為總細胞數，根據熒光顏色計單標、雙標的陽性細胞數。陽性細胞率=陽性細胞數/總細胞數×100%。對計數結果進行統計學分析。

1.7統計學分析 實驗至少重復3次，使用軟件SPSS18.0進行t檢驗。

2 結 果

2.1TGF-β抑制劑對ESCs向NSCs分化的影響 ESCs經N2B27培養基誘導9 d后，進行NSCs標志物Nestin的免疫熒光染色(見圖1)。Nestin陽性細胞呈紅色，細胞細長，部分細胞呈放射狀排列。實驗組和對照組均可見明顯的神經上皮細胞形成的典型結構──神經花環結構。細胞計數結果顯示，對照組Nestin陽性率(60.100%±2.900%)顯著低于實驗組(69.600%±0.780%，P<0.01)。qRT-PCR結果表明實驗組中Nestin基因的表達水平(1.803±0.296)明顯高于對照組(1.000±0.076，P<0.05)。

2.2TGF-β抑制劑對ESCs向神經元分化的影響 實驗組和對照組的ESCs經單層貼壁培養誘導為NSCs后，繼續以分化培養基培養7 d，然后進行β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ，神經元早期標志物)免疫熒光染色(圖2)。熒光顯微鏡下見β-tubulinⅢ陽性細胞呈綠色，胞體較NSCs明顯增大，呈梭形或橢圓形，有1～2條細長突起自胞體發出。對照組β-tubulinⅢ陽性率(26.400%±1.442%)明顯低于實驗組(42.900%±2.961%，P<0.001)。qRT-PCR結果表明實驗組β-tubulinⅢ表達量比對照組提高47.1%(P<0.001)，對照組為1.000±0.032，實驗組為1.471±0.062。

標尺=100 μm；下圖同圖1 ESCs在N2B27培養基中培養9 d后，進行Nestin免疫熒光染色)

圖2 實驗組和對照組的NSCs經分化培養基培養7 d后，進行β-tubulinⅢ免疫熒光染色

2.3TGF-β抑制劑對ESCs向DA能神經元分化的影響 將實驗組和對照組來源的NSCs向DA能神經元誘導分化后，進行MAP2(成熟神經元標志物)和TH(DA神經元標志物)染色。MAP2陽性細胞為紅色，TH陽性細胞呈綠色，MAP2和TH均為陽性的細胞，圖片經疊加呈現黃色(見圖3)。可見TH陽性細胞均為MAP2陽性，而MAP2陽性細胞僅部分為TH陽性，這表明分化終末的成熟神經元中只有一部分細胞是DA能神經元。TH+/MAP2+陽性細胞輪廓清晰，胞體大而飽滿，呈類圓形或橢圓形，發出一個或兩個細長突起，部分細胞也可見胞體發出分支較多的樹突。對照組TH+/MAP2+陽性率為7.100%±0.768%，實驗組為14.000%±1.550%，差異有統計學意義(P<0.01)。qRT-PCR結果顯示，實驗組多巴胺能神經元標志物TH(1.353±0.045)和成熟神經元標志物MAP2的表達量(1.252±0.031)分別比對照組(1.000±0.052、1.000±0.014)提高35.3%(P<0.01)，25.2%(P<0.05)。

圖3 將實驗組和對照組的NSCs向DA能神經元誘導后，進行TH、MAP2免疫熒光染色

3 討 論

脊椎動物TGF-β超家族根據配體不同可以劃分為兩個亞家族：①TGF-β/活化素(Activin)/Nodal亞家族；②骨形態發生蛋白(BMP)/生長分化因子(GDF)/苗勒管抑制物(MIS)亞家族〔6〕。TGF-β信號通路的受體包括Ⅰ型受體(也叫ALK受體)和Ⅱ型受體。在進行信號傳導時，Ⅰ型受體和Ⅱ型受體組成的復合物與TGF-β超家族的配體結合，導致Ⅱ型受體首先被激活，激活的Ⅱ型受體隨后磷酸化Ⅰ型受體。活化的Ⅰ型受體又進一步激活受體活化型Smad蛋白(R-Smads)，R-Smads與共同通路型Smad 蛋白(Co-Smad4)結合并進入細胞核，調控下游基因的轉錄〔11〕。TGF-β超家族在細胞生長遷移、增殖分化、生存凋亡等過程中發揮重要作用〔12，13〕，文獻報道同時抑制TGF-β信號通路的兩個亞家族能促進多能性干細胞向神經譜系分化〔14〕。

TGF-β/Activin/Nodal亞家族能維持ESCs的多能性，抑制這些信號通路可觸發ESCs分化〔15〕。BMP信號通路是BMP/GDF/MIS亞家族的一個分支，它抑制ESCs的神經分化〔16〕。BMP-4是BMP信號通路的一個重要成員，BMP-4除了能維持ESCs的自我更新能力外，還能抑制神經分化而促進細胞表達與中胚層分化相關的標志物〔16，17〕。A83-01通過選擇性抑制TGF-β的Ⅰ型受體ALK5、Activin/Nodal的Ⅰ型受體ALK4和Nodal的Ⅰ型受體ALK7來阻斷TGF-β/Activin/Nodal信號通路〔18〕。而Noggin能高親和力的結合BMP2、BMP4、BMP7，阻止它們與受體結合從而促使ESCs向神經譜系分化〔15〕。需要值得注意的是，在Ying等〔10〕的單層貼壁培養神經誘導方法中，ESCs在N2B27培養基中培養4 d，就有超過60%的細胞表達Sox1(一個重要的NSCs標志物)，這說明絕大多數ESCs的分化命運在早期就已經被決定。而TGF-β信號通路在早期胚胎的神經誘導過程中發揮關鍵作用，神經發育的“默認模式”(default model)理論認為消除TGF-β信號可使胚胎細胞獲得向神經元分化的命運，這個過程無須伴隨形成中、內胚層細胞〔8〕。

本文表明經TGF-β抑制劑處理的ESCs更容易分化為DA能神經元。在早期大腦發育過程中，中腦DA能神經元起源于中腦腹側中線，它的發育依賴于兩個關鍵的腦部中心(底板、峽部)所產生的分化信號：SHH、FGF8和Wnt-1〔19〕，其中SHH和FGF8的共同作用是神經管中不同位置的DA能神經元形成的充分必要條件〔20〕。BMP來源于神經管背側，能拮抗分泌自底板的SHH，削弱SHH信號通路的作用〔21〕。當使用抑制劑阻斷了BMP的活性后，可增強細胞對SHH的反應性〔22〕。這可能從一方面解釋了使用TGF-β抑制劑后ESCs向DA能神經元分化增多的原因。

本研究表明TGF-β信號通路在調控ESCs神經分化過程中發揮重要作用。然而，控制ESCs神經分化的細胞因子和信號通路繁多且復雜，還可能與TGF-β信號通路發生串話(cross talking)作用，這需要進一步的研究。