Cyclin G2在人食管鱗癌組織中的表達及意義

劉玉含 康運凱 閆 琛 魏 攀

(鄭州人民醫院檢驗科，河南 鄭州 450003)

食管癌的發生是一個復雜的過程，在分子水平上涉及多個抑癌基因、原癌基因及其相關蛋白的改變〔1〕。細胞周期調控相關蛋白Cyclin G2(CCNG2)是細胞周期蛋白G家族成員之一，已有相關研究表明CCNG2的缺失表達可能導致胰腺癌〔2〕、胃癌〔3〕、急性淋巴細胞白血病〔4〕等一些惡性腫瘤的發生，而CCNG2在食管癌組織中的相關性研究較為少見。本研究采用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫組化法檢測了CCNG2在食管鱗癌中的mRNA和蛋白表達情況，初步探討了CCNG2與食管鱗癌發生發展及轉移的關系及臨床意義。

1 材料和方法

1.1材料收集 28例食管鱗癌及癌旁正常上皮組織取自鄭州人民醫院手術患者，病理結果證實為食管鱗癌，男17例，女11例，年齡<60歲為10例，≥60歲為18例。標本收集后立即置于液氮保存，用于提取RNA。食管鱗癌患者石蠟組織標本59例來自鄭州人民醫院病理科，男35例，女24例，年齡<60歲為20例，≥60歲為39例。全部樣品分別在食管鱗癌癌灶組織和距離腫瘤至少5 cm以外的正常食管黏膜組織處取材，所有組織標本立即用850 ml/L乙醇固定，后脫水、石蠟包埋，5 μm連續切片，行組織病理學診斷和免疫組化染色。病例術前均未接受放療、化療或免疫治療。

1.2主要試劑 Trizol RNA 試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自日本TAKARA公司，特異性引物購自北京奧科生物技術有限公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest公司，小鼠抗人CCNG2單克隆抗體和HRP標記的二抗購自美國Abcam公司，羊免疫組化S-P試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1PCR法檢測CCNG2 mRNA的表達水平 按Trizol試劑說明書的方法提取總RNA，用紫外分光光度儀分析純度和濃度，后取部分總RNA以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。收集的總RNA溶于DEPC處理過的去離子水中，-80℃保存。cDNA的合成按照反轉錄試劑盒說明書進行操作，實驗條件：42℃ 10 min，95℃2 min。采用Primer5.0軟件設計CCNG2引物，CCNG2上游引物：5′-GCTGAGTTTGATTGAGGCTAC-3′，CCNG2下游引物：5′-CACAAGGCTAATACAGATGGT-3′。GAPDH作為內參，GAPDH上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′?；驍U增反應條件：94℃ 5 min(1個循環)；94℃30 s，59℃ 30 s，72℃ 40 s(30個循環)；72℃ 10 min(1個循環)。取5 μl反應產物在含EB的1.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像系統分析以GAPDH為內參，計算CCNG2 mRNA相對表達量。

1.3.2免疫組化SP法檢測CCNG2蛋白的表達水平 采用免疫組化SP法對CCNG2蛋白進行染色，操作步驟按照試劑說明書進行。用PBS緩沖液(0.01 mmol/L，pH=7.4)替代一抗作為陰性對照。以英國Abcam公司提供的陽性切片作為陽性對照。CCNG2主要表達于細胞質和細胞膜，以細胞質和細胞膜出現棕黃色或黃褐色判讀為陽性細胞。評分標準：觀察并記錄組織切片中的兩項指標，染色陽性細胞占細胞總數的百分率和陽性細胞著色程度，綜合評估試驗結果。組織切片中陽性細胞占細胞總數的百分比可分為4級：陽性細胞<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。組織切片中細胞染色強度分為3級：未著色為0分，淡黃色為1分，棕褐色為2分。2項指標的結果相乘得到0分為(-)，≥1分為(+)。染色結果及評分由2位經驗豐富的病理科醫生獨立操作進行。

1.4統計學方法 應用SPSS19.0統計學軟件進行t檢驗、方差分析及χ2檢驗。

2 結 果

2.1食管鱗癌和癌旁正常食管組織中CCNG2 mRNA的表達 CCNG2 mRNA在癌旁正常食管上皮中明顯高表達，而在食管鱗癌中表達較低(圖1)。28例食管鱗癌標本中CCNG2相對表達量為0.263±0.078，而癌旁正常食管組織中CCNG2相對表達量為0.611±0.184，兩組CCNG2 mRNA表達水平差異有統計學意義(P<0.05)。

1，2：食管鱗癌組織；3，4：癌旁正常食管組織圖1 CCNG2和GAPDH mRNA PCR電泳條帶

2.2食管鱗癌和癌旁正常食管組織中CCNG2蛋白的表達 S-P免疫組化分析結果顯示：在56例食管鱗癌組織中CCNG2蛋白陽性表達率為22.03%(13/59)，正常食管上皮中CCNG2的表達率為74.58%(44/59)。經統計學分析，食管鱗癌組織中CCNG2蛋白陽性率顯著低于癌旁正常食管上皮組織(P<0.05)。

2.3CCNG2蛋白陽性表達與食管鱗癌臨床病理資料之間的關系 CCNG2蛋白的表達水平與食管鱗癌的組織分化程度、TNM分期、浸潤程度和有無淋巴結轉移相關(P<0.05)，在不同性別和年齡患者中，CCNG2的表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 CCNG2蛋白陽性表達與食管癌臨床病理特征之間的相關性

3 討 論

CCNG2基因定位于人染色體4q21.1〔5〕，在細胞周期調控中起負性調節，發揮阻滯細胞周期進程，誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長的作用〔6〕。CCNG2作為一種新的腫瘤標志物正逐漸引起研究者的關注，CCNG2基因表達缺失可增加細胞的黏附能力，使腎細胞癌的癌細胞更易通過血液或淋巴液轉移到遠處器官，同時CCNG2基因的表達下降可導致細胞周期相關蛋白依賴激酶(CDK)2的過度表達，進一步加速腫瘤細胞的增殖〔7〕。Li等〔8〕對甲狀腺癌K1細胞進行CCNG2轉染，發現甲狀腺癌K1細胞的增殖受到抑制，細胞發生G0/G1期的阻滯，細胞凋亡增多，同時CDK2表達下降，因此認為，CCNG2可影響細胞周期調控。Kim等〔9〕報告稱CCNG2在抑制口腔癌發生轉移的過程中發揮了重要的作用。本研究顯示，CCNG2 mRNA和蛋白在食管鱗癌組織中的陽性率顯著低于正常食管組織，說明CCNG2在食管鱗癌中可能起抑癌基因的作用，有淋巴結轉移食管鱗癌患者CCNG2陽性率低于無淋巴結轉移食管鱗癌，在臨床分期中，Ⅲ期和Ⅳ期食管鱗癌CCNG2陽性率低于Ⅰ期和Ⅱ期食管鱗癌，這與Sun等〔10〕在結腸直腸癌組織中研究結果大致相同，提示CCNG2的低表達與食管鱗癌的侵襲轉移密切相關。中低分化的食管鱗癌患者中的CCNG2陽性率低于高分化食管鱗癌，這與Ye等〔11〕在鼻咽癌組織中的研究結果大致相同，提示CCNG2可能是參與食管鱗癌進展的有價值的分子標志物之一。綜上所述，CCNG2的缺失表達與食管鱗癌的發生發展、浸潤和轉移相關，CCNG2可作為食管鱗癌早期診斷及預后評估的一個重要指標。