心肌缺血小鼠牛磺酸代謝和保護(hù)作用的分子機(jī)制

張?jiān)隼?劉 星 胡 靜 杜書迪 任鳳云

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

心肌缺血會(huì)對(duì)機(jī)體心臟產(chǎn)生很多不良的后果，造成的直接后果是降低其心肌細(xì)胞有氧代謝功能，減少其產(chǎn)能，使心臟活動(dòng)時(shí)所需的能量供應(yīng)減少，甚至?xí)a(chǎn)生心律失常及心力衰竭〔1,2〕。盡管目前臨床上的再灌注手段可以在一定程度上緩解心肌缺血及頓抑心肌，但已經(jīng)造成的損傷心肌的修復(fù)困難及缺血再灌注造成的新的心肌損傷導(dǎo)致再灌注治療的部分病人依然產(chǎn)生心力衰竭和左心室重構(gòu)〔3,4〕。因此在進(jìn)行再灌注治療之前采取心肌保護(hù)藥物治療可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同的效果〔5〕。牛磺酸(Taurine)屬于一類β-氨基酸旳亞磺酸類似物，屬于機(jī)體內(nèi)含量最高的游離氨基酸〔6〕。牛磺酸對(duì)于機(jī)體的許多組織及細(xì)胞都存在一定程度的保護(hù)作用〔7,8〕。研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸一般是通過抑制細(xì)胞凋亡、減少脂質(zhì)過氧化損傷、穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)控細(xì)胞滲透壓、清除氧自由基及維護(hù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等作用機(jī)制，從而產(chǎn)生保護(hù)缺血所引發(fā)的心肌損傷、避免動(dòng)脈粥樣硬化和調(diào)控血壓的作用〔9,10〕。目前在心肌缺血的病理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞內(nèi)牛磺酸的代謝和保護(hù)作用的分子機(jī)制的研究較少。本研究探討牛磺酸對(duì)2型糖尿病大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性昆明種小鼠30只，體質(zhì)量18～22 g，由中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(購于武漢醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。隨機(jī)分為模型組(異丙腎上腺素2 mg· kg-1· d-1，ip.，西南藥業(yè)股份有限公司)、正常對(duì)照組(生理鹽水，10 ml·kg-1·d-1，ig.)、牛磺酸組(牛磺酸，400 mg· kg-1·d-1，ig.，蘇州弘森藥業(yè)有限公司)，每組10只。

1.2小鼠心肌缺血模型的建立 各組分別采取劑量(0.1 ml/10 g)灌胃預(yù)防給藥，1次/d，連續(xù)1 w。第5天除正常對(duì)照組外，其余各組預(yù)防給藥30 min后，腹腔注射0.02%的異丙腎上腺素(ISO)造模，正常對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)3 d。末次給藥后1 h，小鼠眼球采血處死，將血清分離待測(cè)。

1.3生化指標(biāo)測(cè)定 造模12 h和3 d，小鼠眼球采血，取血2 ml到試管中，離心3 000 r/min 15 min后，提取上清液，對(duì)小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量進(jìn)行測(cè)定。采用鄰苯三酚比色法對(duì)SOD活性進(jìn)行測(cè)定，采用硫代巴比妥比色法對(duì)MDA含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4心肌含水量(MWC)及心肌指數(shù)(MI)的測(cè)定 取血完成后，處死小鼠快速取出完整心臟，在冰的生理鹽水中清洗淤血后，將大血管及結(jié)締組織進(jìn)行去除，采取濾紙將水分吸干后，稱取其濕重。然后放到干燥箱中，在110℃下干烤8 h后，再稱取其干重。MWC=(濕重-干重)/濕重×100%;MI=濕重/體重×100%。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠白細(xì)胞介素(IL)-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)的水平 采取空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀對(duì)450 nm處的OD值進(jìn)行測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為橫坐標(biāo)，IL-6以濃度0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/μl為縱坐標(biāo)，CRP以濃度0、5、10、20、50、100 ng/μl為縱坐標(biāo)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線采取軟件Curve Expert1.3。根據(jù)樣品的OD值采取Excel WPS計(jì)算相應(yīng)濃度。

1.6Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 取液氮凍存好的小鼠心肌組織，將其研磨成粉末，充分裂解30 min后，在4℃的條件下進(jìn)行15 000 r/min離心20 min，提取上清，根據(jù)聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白活性測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)(碧云天生物技術(shù)研究所)對(duì)蛋白定量進(jìn)行測(cè)定。將30 μg蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將電泳分離好的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫條件下在5%脫脂牛奶中進(jìn)行反應(yīng)1 h，充分洗滌后分別添加一抗小鼠抗人胞TAUT單克隆抗體(1∶1 000)，兔抗鼠半胱氨酸雙加氧酶(CDO)多克隆抗體(1∶1 000)及兔抗人半胱氨酸亞磺酸脫羧酶(CSD)單克隆抗體(1∶1 000)后，在4℃的條件下反應(yīng)過夜，充分洗滌后添加二抗辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)或者HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)，在室溫條件下反應(yīng)30 min，充分洗滌后，采取電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)1 min，采用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照觀察。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血清SOD活性及MDA含量的比較 模型組、牛磺酸組與正常對(duì)照組比較，血清總SOD活性明顯下降，MDA含量明顯上升(P<0.05)。牛磺酸組與模型組相比，血清總SOD活性明顯升高，MDA含量明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清SOD活性及MDA含量的比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2各組心肌MWC比較 與正常對(duì)照組比較，模型組及牛磺酸組MWC明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，牛磺酸組MWC顯著減少(P<0.05)，對(duì)模型組增加部分的抑制率達(dá)71.05%，見表2。

2.3各組MI比較 與正常對(duì)照組比較，模型組及牛磺酸組MI明顯提升(P<0.05)。與模型組比較，牛磺酸組MI明顯降低(P<0.05)，對(duì)模型組增加部分抑制率為75.29%，見表2。

表2 各組MWC、MI比較

2.4各組細(xì)胞因子IL-6、CRP比較 與正常對(duì)照組比較，模型組及牛磺酸組各時(shí)間段IL-6、CRP表達(dá)水平明顯提升(P<0.05)。與模型組比較，牛磺酸組IL-6、CRP表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表3和表4。

表3 各組細(xì)胞因子IL-6水平比較

表4 各組細(xì)胞因子CRP水平比較

2.5各組心肌組織TAUT、CDO和CSD表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型組和牛磺酸組心肌組織TAUT的表達(dá)下調(diào)；與模型組比較，牛磺酸組心肌組織TAUT蛋白的表達(dá)上調(diào)。與正常對(duì)照組比較，模型組和牛磺酸組心肌組織CDO及CSD蛋白的表達(dá)上調(diào)；與模型組比較，牛磺酸組心肌組織CDO及CSD蛋白的表達(dá)下調(diào)，見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)心肌組織TAUT、CDO、CSD表達(dá)水平

3 討 論

心肌缺血一般都會(huì)導(dǎo)致缺氧，缺氧直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞有氧代謝功能降低〔11〕。大劑量ISO可引起心肌收縮力提升，心率加快，心肌耗氧顯著高于供氧，從而引發(fā)心肌缺血〔12,13〕。目前研究認(rèn)為ISO誘導(dǎo)的心肌損傷和心肌相對(duì)缺血缺氧、膜通透性變化、心肌細(xì)胞產(chǎn)生水腫及氧自由基損傷等具有不同程度的關(guān)系〔14〕。SOD屬于一種自由基清除酶，其活性的高低反映機(jī)體清除自由基的能力，MDA屬于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的關(guān)鍵終產(chǎn)物，對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定能夠間接反映機(jī)體中自由基水平和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度〔15〕。

牛磺酸屬于細(xì)胞保護(hù)劑，存在清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化的作用，能夠緩解由于缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞壞死，對(duì)心肌缺血損傷具有較佳的保護(hù)作用〔16,17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明心肌缺血導(dǎo)致小鼠的心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷，心肌細(xì)胞產(chǎn)生水腫。牛磺酸有較佳的保護(hù)心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及改善心肌水腫的效果，牛磺酸可能通過提升心肌組織清除氧自由基能力，抑制心肌組織脂質(zhì)過氧化物生成等作用機(jī)制來緩解心肌缺血損傷。

炎性細(xì)胞因子IL-6和CRP為十分常見的炎癥細(xì)胞因子，對(duì)心功能障礙的發(fā)生發(fā)展具有關(guān)鍵作用。臨床上一般將測(cè)定血清IL-6和CRP的水平作為評(píng)估心肌損傷病人病情嚴(yán)重程度的關(guān)鍵參考指標(biāo)〔18,19〕。本實(shí)驗(yàn)說明牛磺酸能夠明顯降低炎性細(xì)胞因子IL-6及CRP的水平，從而緩解由于炎性介質(zhì)介導(dǎo)的損傷，進(jìn)而可能起到心肌保護(hù)效果。

TAUT一般存在于細(xì)胞膜上，TAUT對(duì)于保持細(xì)胞內(nèi)牛磺酸的濃度具有十分關(guān)鍵的作用。在CDO的作用下，半胱氨酸能夠產(chǎn)生半胱氨酸亞磺酸，而半胱氨酸亞磺酸在CSD和P5P旳作用下，產(chǎn)生連二亞硫酸，最終在連二亞硫酸脫氧酶的作用下產(chǎn)生牛磺酸〔20,21〕。CDO及CSD在牛磺酸的合成過程中具有十分關(guān)鍵的作用〔22〕。本文結(jié)果證實(shí)了在心肌缺血及缺氧的狀況下，心肌細(xì)胞表面TAUT表達(dá)數(shù)量的下調(diào)抑制了牛磺酸向心肌細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，牛磺酸能夠提升了心肌細(xì)胞內(nèi)TAUT蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)TAUT從胞質(zhì)入核，與TAUT基因上游啟動(dòng)子區(qū)的TonE結(jié)合，上調(diào)TAUT蛋白的表達(dá)，抑制了CDO和CSD蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致牛磺酸向心肌細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)明顯增加。

綜上，牛磺酸對(duì)小鼠心肌缺血具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是提升氧自由基清除系統(tǒng)活性，減少脂質(zhì)過氧化，上調(diào)TAUT的表達(dá)，下調(diào)CDO及CSD蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮其對(duì)心肌缺血的細(xì)胞保護(hù)作用。