大蒜素對阿霉素誘導慢性心衰大鼠心功能及血精氨酸血管加壓素、尿水通道蛋白-2的影響

吳海波 王云燦 王學超

(河北省人民醫院心內六科，河北 石家莊 050000)

阿霉素是臨床常用的廣譜高效腫瘤化療藥物，該藥物主要作用于DNA化學結構，在多種腫瘤臨床治療中均得到廣泛應用。但是阿霉素具有強烈的細胞毒性作用，長期應用可導致中毒性心肌炎、心律失常、心肌病、慢性心力衰竭(CHF)等〔1〕。據統計〔2〕，采用阿霉素化療的腫瘤患者慢性心衰發病率異常高于單純慢性心衰者，其可能原因與長期服用抗腫瘤物導致心臟負擔過重物密不可分，縮短患者生存年限。目前，對于阿霉素性慢性心衰疾病并沒有特效的藥物，然而，據有關資料報道大蒜素具有保護心肌的功能〔3,4〕。本研究探究大蒜素對阿霉素誘導慢性心衰大鼠心功能的影響，并分析其血精氨酸血管加壓素(AVP)、尿水通道蛋白(AQP)-2變化。

1 材料與方法

1.1實驗動物 90只SD雄性大鼠，體質量200～250 g，7周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司實驗動物中心，實驗動物許可證：SCXK(京)2009-0004。

1.2實驗試劑和儀器 實驗中所用主要儀器和試劑為阿霉素(武漢宏信康精細化工有限公司)、大蒜素(楊凌慈緣生物技術有限公司)、AVP試劑盒(IBL)、AQP-2試劑盒(Santa cruz)、水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)、大鼠隔離籠具(北京佳源興業科技有限公司)、玉米油(Spectrum)、多普勒超聲儀(徐州市凱信電子設備有限公司)、手術剪刀(上海華美實業有限公司)、真空采血管(浙江拱東醫療科技有限公司)、全自動酶標儀(美國BioX科技有限公司)、-20℃冰箱(青島海爾)、高速離心機(北京時代北利離心機有限公司)、靜脈留置針(溫州華利醫療器械有限公司)。

1.3動物模型 SD大鼠適應性喂養1 w后，水合氯醛麻醉并固定SD大鼠于專用固定器中，將大鼠尾部浸泡于45～50℃溫水1 min，75%酒精擦拭尾部，阿奇霉素共注射8次，分別于2、4 d皮下注射1 mg/kg，6 d、8 d皮下注射2 mg/kg，10 d、12 d皮下注射3 mg/kg，14 d、16 d皮下注射4 mg/kg。停止注射1 w內監測大鼠心衰情況，并根據建模過程中大鼠的飲食，體重，精神狀態變化給予適當的護理，保證模型成功。

1.4藥物處理方法 正常組和模型組10 ml/kg玉米油皮下注射處理，A、B、C、D大蒜素組分別尾靜脈緩慢注射含10、15、20、25 mg/kg劑量大蒜素的10 ml/kg玉米油。1 w 1次，連續注射8 w，同時給予抗生素等輔助處理，停藥、禁食24 h后分別收集SD大鼠尿液5 ml，并斷頸心臟采血5 ml。

1.5心功能檢查方法 測定SD大鼠開始使用大蒜素到停止用藥期間的心功能指標，求平均值。麻醉固定大鼠于手術板上，仰臥心前備皮，西門子彩色多普勒超聲儀(ACUSO Sequoia 512，5L8w-s型高頻探頭，14.0 MHz)檢查超聲心功能指標。記錄左室舒張末內徑(LVEDD)、左室收縮末內徑(LVESD)、左室短軸縮短率(FS)、左室重量(LVM)和左室射血分數(LVEF)。

1.6血液、尿液處理方法 大蒜素使用8 w后，取大鼠尿液標本于試管中，同時斷頸心臟采血于采血管中，尿液和血液標本1 h內在4℃的條件下離心(3 000 r/min)25 min，取上清，-20°冰箱保存，待用。

1.7血AVP、尿AQP-2檢測方法 根據試劑盒說明書步驟進行操作：①加樣：相應反應孔中分別添加100 μl的標準品和待測液體，充分混勻，酶標板封蓋，并放置于37℃水浴恒溫中反應120 min；②配液：蒸餾水以20倍稀釋洗滌液，備用；③洗板：用稀釋20倍后的洗漆液充分清洗反應板4～6次，并于濾紙上印干；④分別對應孔添加酶標抗體工作液100 μl，并將反應板37℃水浴條件下恒溫反應60 min，洗板4～6次；⑤顯色：每孔分別加底物工作液100 μl，37℃避光反應15～20 min；⑥終止：加終止液100 μl，混勻，酶標儀測450 nm下的吸光值(OD)；⑦所測OD值-空白OD值作為縱坐標，標準品濃度為橫坐，得到標準曲線，根據樣品OD值查出對應濃度大小。

1.8統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行ANOVA檢驗。

2 結 果

2.1心功能變化 模型組心功能各項指標與正常組比較均差異有統計學意義(P<0.05)：LVEDD、LVESD、LVM明顯增高，FS、LVEF明顯降低。A組LVEDD明顯高于正常組和C、D組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；LVESD值明顯高于正常組和B、C、D組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；LVM同樣明顯高于正常組和B、C、D組(P<0.05)，但與模型組差異無統計學意義(P>0.05)；FS明顯低于正常組和D組(P<0.05)，高于模型組(P<0.05)，與B、C兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)；LVEF明顯低于正常組和C、D組(P<0.05)，較模型組明顯增高(P<0.05)，但與B組比較差異無統計學意義(P>0.05)。B組LVEDD和LVESD均明顯高于正常組和C、D兩組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；LVM明顯高于正常組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)，但與C、D組差異無統計學意義(P>0.05)；FS明顯低于正常組和D組(P<0.05)，高于模型組(P<0.05)，與C組比較差異無統計學意義(P>0.05)；LVEF明顯低于正常組(P<0.05)，高于模型組(P<0.05)，與C、D組比較差異無統計學意義(P>0.05)。C組LVEDD、LVESD、FS、LVEF與正常組和模型組分別比較均差異具有統計學意義(P<0.05)，LVM與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；與D組比較，只有LVESD差異有統計學意義(P<0.05)。D組LVEDD、FS、LVM與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)；5個指標與模型組比較均差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2血AVP、尿AQP-2含量變化 模型組血AVP、尿AQP-2與正常組比較均明顯增高(P<0.05)。A、B、C、D組血AVP和尿AQP-2均顯著高于正常組(P<0.05)，且低于模型組(P<0.05)，并隨著劑量的增加呈現依次降低趨勢，D組血AVP，尿AQP-2含量明顯降低。A、B、C、D組間兩兩比較，均差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組心功能指標對比

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與A組比較:3)P<0.05；與B組比較:4)P<0.05；與C組比較:5)P<0.05；下表同

表2 各組血AVP、尿AQP-2水平比較

3 討 論

目前，CHF發病機制尚不清楚，且導致其發病的因素很多，比如高血壓、糖尿病及心臟毒害作用藥物等，相關研究顯示，毒害類藥物引起的慢性心衰發病率越來越高，且在免疫力低下的患病老年人及腫瘤晚期患者中較為普遍〔5〕。調查顯示〔6〕，由阿霉素誘導的慢性心衰患者占據很高的比例，特別是在腫瘤患者中，由于其臨床治療效果差，患者生存質量嚴重降低。一旦發生CHF，患者心功能將會逐漸被削弱，嚴重者甚至可能危及生命。研究指出〔7〕，在CHF患者中，由于機體內壓力感受器被激活導致交感神經異常興奮，進而激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)，使得AVP合成和分泌均明顯增加，進而可導致機體對水分和鈉的重吸收顯著增加，加重機體損傷；另一方面，血VAP可以和腎臟V2受體相結合，進而啟動信號傳導級聯反應，使得磷酸化AQP-2移位，促進水分子跨膜轉運〔8〕。該因子對腎上腺皮質激素分泌也有明顯促進作用，使得尿AQP-2水平增加。據Della-Morte等〔9〕研究表明，由阿霉素誘導的CHF患者病程越長、病情越嚴重，血VAP和尿AQP-2水平也越高，提示二者均和CHF病情存在一定關聯。

研究表明〔10〕，大蒜素可改善阿霉素誘導慢性心衰大鼠心肌結構，恢復心肌細胞的整齊排列，清晰橫紋等正常細胞現象，同時有效調整白細胞介素(IL)-10/腫瘤壞死因子(TNF)-α比值，實現對心肌細胞的保護作用，推測大蒜素可能通過改善CHF心肌結構和功能增強臨床療效。趙文萃等〔11〕研究顯示，大蒜素可有效改善CHF大鼠的LVESD、LVEDD、FS及射血分數，降低血管緊張素(Ang)Ⅱ，TNF-α水平，有利于大鼠心肌形態和心室重構。大蒜素在阿霉素誘導的CHF動物模型中應用，能夠改善心功能，同時有效控制細胞因子水平，推測可在CHF患者臨床中推廣。同時國外最新研究認為對CHF患者采用大蒜素同樣可通過減輕細胞毒性改善患者的心臟功能，控制心衰〔12〕。也有研究認為大蒜素可防止大鼠心肌氧化損傷，抑制細胞內活性氧產生，可能對CHF的改善有一定的影響〔13〕。目前認為大蒜素具有抗衰老、預防心腦血管疾病、抗腫瘤等多種藥理作用，其主要機制為抑凋亡、抗氧化損傷、減少Ca2+載體流失〔14〕，可能具有減輕心衰患者癥狀，保護心臟功能的作用，但是并沒有充分的數據證實。另有國外研究認為〔15〕，大蒜素對CHF大鼠模型交感神經興奮可能有抑制作用，進而減輕對RAAS的刺激，減少VAP分泌量，使其對腎上腺皮質激素分泌促進作用減輕，故而血VAP、尿AQP-2水平顯著降低，且大蒜素干預濃度越高，其降低幅度越明顯，推測療效改善與此緊密相關。

本研究結果說明大蒜素對阿霉素誘導慢性心衰大鼠的心功能及血AVP、尿AQP-2水平含量具有明顯積極的影響，且存在劑量依賴性，可能為慢性心力衰竭疾病的控制提供一定的參考價值，但是其藥物作用機制和臨床安全性并不清楚，還需深入研究。