化瘀解毒方含藥血清體外抑制A549腫瘤細胞作用及其機制

張俊萍 魏 征

(河南省中醫藥研究院，河南 鄭州 450004)

化瘀解毒方是河南省中醫藥研究院附屬醫院內部制劑，臨床運用治療肺癌多年，取得了良好的療效。本研究以人肺癌A549細胞為研究對象，對其進行體外實驗研究，探討化瘀解毒方抗肺癌的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 化瘀解毒方藥免煎顆粒劑杜氏改良培養基(DMEM培養基)、胎牛血清，GIBCO，美國；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)，Sigma，美國；青霉素、鏈霉素，晶美生物科技有限公司，中國；Matrigel 基底膜基質膠(Becton，Dickinson and Company，美國)；抗-蛋白激酶B(Akt)(#4691)，抗-3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)1(#5662)，抗-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)(#4225)，抗-磷酸化(p)Akt(#4058)，抗-p-PDK1(#3061)，抗-p-PI3K(#4228)和抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(#5174)，山羊抗兔IgG，Cell Signaling Technology，美國)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒(Thermo，美國)；預染蛋白Marker(Fermentas，美國)；聚偏氟乙烯(PVDF)轉移膜(Millipore，美國)。

1.2實驗儀器 醫用X光膠片(Fujifilm，日本)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司，中國)，酶標儀(Bio-Rad，USA)，TY-80B 脫色搖床(武漢格萊莫檢測設備有限公司，中國)，細胞培養箱(Thermo，美國)，X光洗片機(江蘇省泰興市泰龍醫用設備廠，中國)。Transwell 板(Costar，美國)，實時定量PCR 擴增儀(ABI，美國)，核酸定量儀(Thermo，美國)。

1.3樣品準備 按照復方中的比例，分別稱取半枝蓮61.00 g、廣木香19.52 g、雞內金19.52 g、三七9.76 g、全蝎6.10 g、壁虎6.10 g。加8倍量水進行回流提取，提取2次，合并提取液，濃縮，烘干至浸膏狀，冷凍干燥機進行凍干處理，得粉末，上述粉末粉碎過100目篩，細粉稱重。蒸餾水倍比稀釋成含生藥1 g/ml的水煎劑，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱備用。環磷酰胺(CTX)粉針劑：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產，200 mg/支，與0.9%氯化鈉溶液配置制20 mg/ml的溶液，4℃冰箱保存。

1.4含藥血清制備 大耳白兔12只，隨機分為化瘀解毒方藥高劑量組、低劑量組、CTX組、生理鹽水組，每組3只。實驗前禁食12 h，根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”〔1〕，化瘀解毒方藥高、低劑量組分別用每天15、30 g/kg劑量口服灌胃；生理鹽水組給予相同劑量的生理鹽水1次/d，連灌1 w；CTX組第1天予20 mg/kg腹腔注射，后6 d給予等劑量生理鹽水灌胃。于末次給藥后1 h，無菌條件下心臟采血，分離血清，56℃、30 min下補體滅活，-20℃保存備用。

1.5細胞培養 腫瘤細胞株均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。在37℃、5% CO2條件下，于含100 U/ml 青霉素、100 U/ml鏈霉素和10%胎牛血清的 DMEM 培養液中培養。

1.6細胞增殖抑制實驗 分別取對數生長期的A549細胞計數，接種于 96 孔培養板中，每孔4×103個細胞。培養 24 h后，分別加入生理鹽水組、化瘀解毒方藥高、低劑量組、CTX組的含藥血清，空白對照組加入等體積的胎牛血清，每個濃度3個復孔。繼續培養12～72 h后，每孔加入10 μl MTT(4 mg/ml)，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入200 μl DMSO，振蕩混勻，用酶標儀在 570 nm 處測定吸光度值(OD570)，計算抑制率。公式：抑制率(%)=(1-給藥組OD570/空白對照組OD570)×100%。

1.7細胞黏附實驗 96孔板底部孵育5 mg/ml matrigel，每孔200 μl，4℃過夜待用。取不同對數生長期的A549細胞，計數，接種于96 孔培養板中，每孔4×103個細胞。培養 24 h后，以不同濃度的化瘀解毒方提取物處理不同時間。在96孔板中孵育3 h后，細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍去除未貼壁的細胞。每孔加入 5 mg/ml MTT，每孔10 μl，37℃孵育4 h。去除上清液，每孔加入200 μl DMSO 溶解結晶，570 nm處檢測吸光度。計算黏附細胞百分比。

1.8細胞遷移實驗 采用Transwell細胞培養系統檢測細胞遷移。在37℃下，Transwell板上腔下表面包被fibronectin(10 μg/ml)2 h待用。A549細胞經不同濃度化瘀解毒方提取物處理48 h后，混懸于無血清培養液中加入上腔。下腔加入含20%胎牛血清的培養液。24 h后用結晶紫染色檢測遷移至下表面的細胞數。顯微鏡下計數細胞數，每組至少5個視野。計算遷移率，遷移率=給藥組/溶劑對照組×100%。

1.9細胞侵襲實驗 采用Transwell細胞培養系統檢測細胞侵襲。Transwell板上腔加入5 mg/ml matrigel，每孔100 μl，37 ℃下孵育4 h待用。A549細胞經不同濃度化瘀解毒方提取物處理48 h后，處理的細胞混懸于無血清培養液中加入上腔。下腔加入含20%的胎牛血清培養液。24 h后，用結晶紫染色檢測侵襲至基質內的細胞數。顯微鏡下計數細胞數，每組至少5個視野。計算侵襲率，侵襲率=給藥組/溶劑對照組×100%。

1.10細胞總RNA提取 取對數生長期的A549細胞，接種于6孔板中。24 h后，不同濃度化瘀解毒方提取物處理A549腫瘤細胞株12 h。棄6孔板中上清培養液，加入1 ml Trizol試劑反復吹打細胞后，加入200 μl氯仿。混勻，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，加入同體積異丙醇，混勻，12 000 r/min離心10 min。沉淀用70% 乙醇洗1遍，加入無核酸酶的水溶解RNA。用核酸分析儀檢測RNA濃度及其質量。

1.11RNA反轉錄及實時定量PCR 取對數生長期的A549細胞，接種于6孔板中。24 h后，A549細胞株經不同濃度化瘀解毒方提取物處理，12 h后采用Trizol提取A549細胞總RNA。采用TaKaRa反轉錄酶進行反轉錄。采用Beacondesigner4.0軟件設計引物。擴增條件：預變性50℃ 2 min；變性95℃ 10 min；延伸：95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，收集熒光信號，在該階段擴增40個循環；第4步做溶解曲線。經繪制標準曲線驗證，各個產物的擴增效率以目標基因與β-actin擴增產物的雙 Delta-C比值分析，計算各組的相對表達情況。

1.12免疫印跡分析 取對數生長期的A549細胞，接種于6孔板中。24 h后，A549腫瘤細胞株經不同濃度化瘀解毒方提取物處理12 h后棄6孔板中上清液，用冰浴的PBS洗滌，在冰上用組織細胞快速裂解液(RIPA)緩沖液抽提。離心取細胞裂解液進行蛋白定量，上樣緩沖液煮樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后采用半干法轉到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含有5%奶粉的Tris緩沖鹽溶液(TBS)封閉過夜，添加一抗37℃孵育4 h，TBST(含Tween-20的TBS)洗膜，二抗孵育1 h，TBS洗滌之后電化學發光法(ECL)顯色，洗片。選用GAPDH作為內參，1∶400稀釋。

1.13數據處理和分析 采用SPSS20.0軟件行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1化瘀解毒方含藥血清對A549細胞增殖的影響 終濃度為5%、10%和20%的化瘀解毒方含藥血清作用48 h劑量依賴性抑制A549腫瘤細胞增殖。其中低劑量組抑制率分別為29%、46%和64%，高劑量組為42%、61%和82%。結果說明，通過代謝后的化瘀解毒方含藥血清可以有效抑制A549腫瘤細胞增殖，具有較好的抗腫瘤作用。見圖1。因此，后續實驗選擇化瘀解毒方含藥血清的終濃度為10%，作用為48 h。

圖1 化瘀解毒方含藥血清劑量依賴性抑制A549腫瘤細胞增殖

2.2化瘀解毒方含藥血清對A549細胞黏附的影響 低劑量和高劑量的化瘀解毒方含藥血清均可抑制A549腫瘤細胞的黏附能力。其中，生理鹽水組含藥血清處理過的A549細胞中39%具有黏附能力，而經過低劑量化瘀解毒方含藥血清處理48 h的A549細胞23%黏附至底板。而高劑量化瘀解毒方含藥血清處理48 h的A549細胞的黏附能力與CTX組大致相同，均為15%黏附至底板。結果說明，化瘀解毒方含藥血清可以較強地抑制A549細胞黏附。

2.3化瘀解毒方含藥血清對A549細胞遷移的影響 在相同放大倍數的視野下，71個生理鹽水組血清處理的細胞遷移至腔室下表面。低、高劑量含藥血清組和CTX組均能顯著抑制A549細胞遷移，遷移至腔室下表面的細胞數分別為41、18和23。說明化瘀解毒方含藥血清可以抑制A549腫瘤細胞的遷移。見圖2。

圖2 化瘀解毒方含藥血清抑制A549細胞遷移(×100)

2.4化瘀解毒方含藥血清對A549細胞侵襲的影響 相同倍數放大視野下，45個生理鹽水組血清處理的細胞侵襲至基質中。然而，低、高劑量含藥血清組和CTX組均能顯著抑制A549細胞侵襲，侵襲至基質中的細胞數分別為28、15和14。說明化瘀解毒方含藥血清可以抑制A549腫瘤細胞的侵襲。見圖3。

圖3 化瘀解毒方含藥血清抑制A549細胞侵襲(×100)

2.5化瘀解毒方含藥血清對細胞中Akt通路的影響 實時定量PCR結果顯示，化瘀解毒方含藥血清不影響A549細胞中PI3K，PDK1和Akt mRNA的表達，說明化瘀解毒含藥血清不能通過抑制Akt信號通路中相關基因的轉錄而抑制腫瘤細胞的增殖。見圖4。免疫印跡結果與實時定量PCR結果一致，化瘀解毒方含藥血清和CTX對PI3K、PDK1和Akt蛋白水平無影響；然而，化瘀解毒方含藥血清顯著抑制A549細胞中Akt蛋白的磷酸化水平，說明化瘀解毒方含藥血清抑制A549細胞增殖、黏附、遷移和侵襲與抑制Akt蛋白的磷酸化有關。見圖5。

圖4 化瘀解毒方含藥血清對A549細胞中PI3K,|PDK1和Akt mRNA表達的影響

圖5 化瘀解毒方含藥血清對A549細胞中Akt通路蛋白表達的影響

3 討 論

在中醫學文獻中，雖無肺癌的病名，但對其體征和癥狀卻早有載錄。如《靈樞·脹論》謂“肺脹者，虛滿而喘咳”。《素問·玉機真藏論篇》謂：“大骨枯槁，大肉陷下，胸中氣滿，喘息不便，內痛引肩項，身熱脫肉破”。《東醫寶鑒》曰：“癰疽發于內者，當審臟腑，如中府隱隱而痛者，肺疽也”，以“疽”字論定了肺癌的惡變性質。肺癌屬中醫的“咳嗽”、“咯血”、“胸痛”等范疇，古又有“肺積”、“痞癖”、“息賁”、“肺壅”之稱〔2〕。古代醫家對肺癌的病機分為正虛、邪實兩個方面〔3〕。《醫宗必讀》所言：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”。《瘍科心得集》中提到“癌瘤者，非陰陽正氣所結腫，乃五臟瘀血、濁氣痰滯而成”。現代醫家對肺癌的病因病機認識的側重點不同，但也分為正虛、邪實兩個方面。雖歷代醫家沒有明確提出瘀毒之名，但從“癥積”“噎嗝”“石瘕”“巖證”等病的病因、病理、證候特點、治療預后等方面的描述，論述了“瘀毒”的部分內容。筆者認為，肺癌是以“瘀毒”為標、“元氣虧虛”為本，將肺癌的中醫證候、病因病機概括為“瘀毒”〔4〕。肺癌瘀毒是由于元氣衰敗，不能行血運津，復因情志、外感、飲食、勞倦等因素，形成頑痰、死血，痰血積久不去，化火成毒所致。瘀與癌毒往往相伴而生，兩者具有同源互生的關系，形成癌毒的環境條件，同樣也是促成血瘀形成的環境條件，在血瘀的狀態下，癌毒更易形成，癌毒與血瘀等邪氣共同作用癌瘤更易發生，癌毒和癌瘤的存在又可進一步加重血瘀的發展和變化。因而，肺內癌毒一旦形成，不僅阻隔經絡氣血，且掠奪水谷精微以自養，導致五臟六腑失卻氣血津液濡潤，逐漸衰竭，而出現咳喘、痰中帶血、胸悶胸痛、氣短、消瘦乏力等癥。化瘀解毒方由全蝎、壁虎、三七、半枝蓮、廣木香、雞內金組成。其中全蝎、壁虎活血解毒為君；輔以三七活血化痰、軟堅散結；佐以半枝蓮解毒抗癌，使以廣木香理氣和胃、疏暢氣血。諸藥合用，共奏活血解毒、軟堅散結、扶正抗癌之功。臨床治療癥瘕痞塊積證，常選用搜剔破瘀之力較強的蟲類藥，以達到破瘀血、消積塊的目的。

PI3K的活性與多種人類腫瘤的發生息息相關。PI3K/Akt通路關鍵分子的抑制可以誘導其細胞周期阻滯，周期相關蛋白表達降低，誘導腫瘤細胞凋亡。本實驗結果顯示：化瘀解毒方提取物呈濃度依賴性抑制體外人肺癌A549腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。雖然化瘀解毒方含藥血清對PI3K，PDK1和Akt總蛋白水平無影響，但顯著抑制A549細胞中Akt蛋白的磷酸化水平。因此，考慮化瘀解毒方的作用機制可能與抑制PI3K/Akt通路有關，但需要進一步探索。