藏藥十八味訶子利尿丸對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護作用

梁沛余 段路路 吳 穹

(青海大學醫學院，青海 西寧 810001)

十八味訶子利尿丸，藏藥名為金尼阿如久杰日布，處方源自《藏醫醫訣補遺》，收錄于《衛生部藥品標準·藏藥》(編號：WS3-BC-0182-95)，是由訶子、余甘子、姜黃、金礞石等十八味藥材經研磨、過篩、泛丸、干燥等藏醫傳統制藥工藝炮制而成的復方制劑，有利尿、降糖等功效〔1〕，其構成藥材中，紅花、小檗皮、蒺藜、余甘子、姜黃、熊膽、牛黃、巴夏嘎等八種藥材現已有科學研究〔2〕證實對腦缺血損傷有一定的保護作用，其余藥材如訶子、刺柏等亦有抗氧化效能的報道，但此藥目前在臨床上主要應用于腎病、糖尿病等癥，科學研究方面亦僅有在成分質量分析、抗菌效能等〔3〕領域的數篇報道，尚無對腦缺血損傷的藥效學及機制的研究。本實驗擬觀測十八味訶子利尿丸預處理對模型大鼠多項指標的影響，證實十八味訶子利尿丸有對抗腦缺血/再灌注損傷的作用并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1動物及分組 SD大鼠80只，雄性，質量(260±20)g，清潔級，購自蘭州大學實驗動物中心，批號：SCXK(甘)2009-0004，于青海大學醫學院SPF 級動物房內飼養。動物隨機等量分為藏藥組、西藥組、模型組及假手術組。

1.2藥品與試劑、儀器 十八味訶子利尿丸(青海省格拉丹東藥業有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司)；其他試劑均由青海大學醫學院機能實驗室提供。BP110S型電子天平(德國Sartorius公司)；離心機(美國Beckman公司)；721型分光光度計(上海精密儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1預處理 藏藥組給予十八味訶子利尿丸(300 mg·kg-1·d-1)干預，西藥組給予尼莫地平(10.8 mg·kg-1·d-1)干預，模型組與假手術組均給予等量0.9% NaCl溶液干預，連續灌胃給藥10 d。

1.3.2造模 末次給藥2 h后，應用加長栓線的新式Zea Longa線栓法建立大腦中動脈閉塞再灌大鼠模型〔4〕。大鼠全麻(水合氯醛腹腔注射)后固定，頸部于正中位做3 cm切口，小心剝離右側頸內動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)和頸總動脈(CCA)，行CCA、ECA結扎。夾閉ICA，在ICA與ECA呈“Y”形分叉處剪切口，將加長線栓(60 mm，常規為40 mm)插入并開放ICA，調整栓線角度，緩慢推入顱內，直至有明顯阻力后停止推進。假手術組除栓線不推入ICA外，其余操作與其他三組完全一致。記錄栓線入顱時間，2 h后拔出栓線實現再灌注。

1.4指標測定

1.4.1行為學測定 缺血2 h再灌注2、12、24 h后按照Bederson等〔5〕建立的5分評分法對各組大鼠神經功能缺陷評分。

1.4.2腦含水量測定〔6，7〕缺血2 h再灌注24 h后，各組隨機取6只大鼠冰盤上斷頭取腦，計算腦組織含水量百分比。

1.4.3腦梗死灶面積〔8，9〕測定及海馬CA1區組織病理學觀察 缺血2 h再灌注24 h后，各組隨機取6只大鼠冰盤上斷頭取腦，冠狀位切成5片，取第1、2、3、5腦片行TTC染色，計算腦梗死灶面積百分比；取第4腦片行硫堇染色，觀察海馬CA1區組織病理學變化，計數存活神經元。

1.4.4腦組織SOD活性及MDA含量的觀測 缺血2 h再灌注24 h后，各組取余下8只大鼠，冰盤上取右側腦組織，勻漿，離心，取上清液按說明書測定腦組織中SOD活性及MDA含量。

1.5統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組大鼠不同灌注時間神經功能缺陷評分比較 在不同灌注時間，與假手術組比較，模型組神經功能缺陷評分均明顯升高(均P<0.05)，十八味訶子利尿丸及西藥尼莫地平均可降低此效應(均P<0.05)，見表1。

2.2各組腦組織含水量及梗死灶面積比較 與假手術組比較，模型組腦組織發生水腫、梗死(均P<0.05)；十八味訶子利尿丸預處理及西藥尼莫地平均可顯著減輕腦組織梗死程度(P<0.05)，可緩解腦組織水腫，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3各組海馬CA1區組織病理學觀測結果比較 見圖1，與假手術組〔(89.83±11.60)個/視野〕比較模型組海馬CA1區神經元胞體結構被破壞，神經元發生固縮壞死，存活神經元數量明顯下降〔(39.00±9.63)個/視野，P<0.05〕；十八味訶子利尿丸預處理和西藥尼莫地平組均可減輕建模損害，對抗神經元胞體損傷，增加神經元的存活量〔(59.67±8.55)個/視野，P<0.05〕。

表1 不同灌注時間神經功能缺陷評分比較(分，

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組腦組織含水量、梗死灶面積比較

圖1 各組海馬CA1區組織病理學比較(硫堇染色，×200)

2.4各組腦組織SOD活性及MDA含量比較 如表3所示，與假手術組比較，模型組腦組織SOD活力降低，MDA的生成增加(均P<0.05)，致使神經元損傷；十八味訶子利尿丸預處理及西藥組均可提高腦組織抗氧化能力(均P<0.05)，減輕自由基損害。

表3 各組腦組織SOD活性、MDA含量比較

3 討 論

腦缺血/再灌注損傷過程涉及多種復雜機制，可誘導神經元發生凋亡〔10〕、壞死、自噬等病理生理改變，最終對腦功能造成不可逆損傷。氧化應激與腦缺血/再灌注損傷關系密切〔11〕，干預氧化應激〔12〕阻止病程進展已成為該研究領域的熱點之一。腦缺血/再灌注損傷過程中，磷脂酶A2活化，大量自由基生成，且腦SOD活力水平處于低值狀態，不能對其進行有效的清除，最終造成自由基積聚及MDA生成增加。自由基可致血管反應性改變，損傷血腦屏障與血管內皮細胞，還可致膜上的磷脂被降解，失去其原有生物學功能，促使神經元固縮凋亡，這與自由基可在膜上發生過氧化反應關系緊密。

自由基可誘導神經元凋亡，其過程與caspase、Bcl等蛋白家族關系密切。目前認為自由基誘導凋亡的主要途徑有：①內質網途徑：腦缺血/再灌注損傷可活化神經元胞內眾多酶類，誘發內質網發生未折疊蛋白反應，腦損傷生成的大量自由基亦參與到此過程中。在眾多因子的作用下，內質網處于持續應激狀態，調控caspase等凋亡蛋白家族的表達，促使神經元凋亡。②線粒體途徑:腦缺血/再灌注損傷時，線粒體呈現應激狀態，大量自由基由此產生，造成線粒體蛋白翻譯改變、內切酶被活化、多種水解酶被激活，致使細胞色素C氧化酶處于低水平，從而介導caspase等凋亡蛋白家族的活化，誘導神經元凋亡。此外，自由基提升線粒體DNA突變率及對呼吸鏈的直接攻擊亦是影響凋亡的重要原因。③死亡受體通路:腦缺血/再灌注損傷時，自由基可通過調節NF-κB、Fas/FasL等〔13〕通路，促進神經元的凋亡。因此，提高SOD活力水平〔14〕，防止自由基集聚，減少MDA在氧化應激下的生成，尋找干預氧化應激的新藥物，對阻止腦缺血/再灌注損傷進程意義重大。

十八味訶子利尿丸為傳統藏藥制劑，其構成藥材中的八種以上現已有科學研究證實對腦缺血損傷有一定的保護作用，其余藥材如訶子、刺柏等亦有抗氧化效能的報道。本實驗研究發現，十八味訶子利尿丸預處理可降低腦缺血/再灌注損傷大鼠神經功能缺陷評分、梗死灶面積，減輕神經元變性，增加神經元存活數量，證實十八味訶子利尿丸可對抗腦缺血/再灌注損傷；十八味訶子利尿丸預處理可使大鼠腦組織中SOD活性水平提高，MDA生成下降，防止自由基積聚，削減自由基對腦組織的負性作用，說明其對腦缺血/再灌注損傷的保護機制與提高機體抗氧化能力關系密切。但由于腦缺血/再灌注損傷機制極為復雜，故其保護效能的具體機制仍需進一步探索。