吉林省北五味子種子種苗帶菌檢驗初步研究

崔麗麗，閆梅霞，馮志偉，金銀萍，許陪磊，王英平※

（1.中國農業科學院特產研究所，長春 130112；2.撫松縣參王植保有限責任公司，吉林 撫松 134504）

種子的質量由種子的純度、活力、健康狀況等因素決定。種子品質是提高作物產量和質量的重要物質基礎。種傳病原菌可以導致種子不育、種子萎縮變小、變色、腐爛壞死和萌發力降低[1]。為保證種子質量，對種子進行健康檢驗尤為重要。五味子〔Schisandra chinensis(Turcz.)Baill〕為木蘭科多年生落葉木質藤本藥用植物，以果實入藥。五味子屬（SchisandraMichx）全世界約有50種，主要分布在東亞地區，在我國約有20種，分布于西南、華南至東北地區。產于東北三省及內蒙古的習稱北五味子（又稱遼五味子），產于南方的習稱南五味子，產于西北地區的習稱西五味子[2]。五味子藥、食兼用，具有較高的藥用和經濟價值。五味子在中醫臨床中應用廣泛，用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內熱消渴、心悸失眠等癥。目前，國內已有報道的五味子真菌病害種類為黑斑病〔鵝掌揪鏈格孢（Alternaria liriodendri T.Y Zhang et J.Z.Zhang）〕[3,4]、根腐病〔尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）〕[3]、莖基腐病〔木賊鐮刀菌（F.equiseti）、茄腐鐮刀菌（F.solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、半裸鐮刀菌（F.semitectum）〕[5]、葉枯病［細極鏈格孢〔A.tenuissima（Fr.）Wiltshire〕］[6,7]、褐斑病［球狀莖點霉〔Phoma glomerata（corad）Wollena ex Hoehapf〕］[8]、白粉病〔五味子叉絲殼菌（Microsphaera schizandrae）〕[9,10]、立枯病（Rhizoctonia solani）[11]、銹病〔五味子春孢銹菌（Aecidiumschisandrae）〕[12]。北五味子是長白山地區特色的植物資源，近年來，人工栽培面積在不斷增加，五味子病蟲害也呈現出上升趨勢，病蟲害防治是北五味子栽培的重要技術環節[13]。目前，有遼寧省北五味子種子、種苗帶菌檢測研究的報道[14,15]。本試驗以吉林省北五味子種子、種苗為對象進行健康檢測，為種子、種苗標準制定提供理論依據，同時為病害防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年10月初分別收集于吉林省撫松縣和吉林省昌邑區左家鎮。種子樣品8份（吉林省撫松縣5份，吉林省昌邑區左家鎮3份），每份約200粒～300粒；種苗樣品10份（撫松縣5份，左家鎮5份），每份20株～30株。

1.2 供試材料處理

1.2.1 種子處理 每1份樣品隨機選取100粒種子，在無菌操作臺中，50粒種子 3%NaClO無菌消毒3min～4min，無菌水沖洗3次；另外50粒種子3%NaClO消毒4min，無菌水沖洗3次，分開種殼和種仁，晾干待用。外部帶菌檢測隨機取樣50粒～100粒種子，無處理，待測。

1.2.2 種苗處理 取1cm～2cm長莖，3%NaClO消毒3min～4min，無菌水沖洗3次，用無菌手術刀平分為5段，每份樣品處理10株，晾干待用。

1.3 檢測方法

1.3.1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）平板法 種子內部帶菌檢測：培養皿（直徑9cm）中倒入10mL已滅菌 PDA制成平板。種子檢測時將已處理好的10個整粒種子、10個種殼、10個種仁分別放入3個培養皿中；種苗檢測時每個培養皿中均勻地放入已處理好的5段莖，1株種苗1個培養皿，25℃、光照和黑暗各12 h交替培養（培養皿應在燈下約25cm處，不堆疊放置）7d～10d。實驗設置不放種子的空白對照，3次重復。

種子外部帶菌檢測：不消毒直接培養，每個培養皿中放置方法和數量與內部帶菌檢測一致。

肉眼觀察菌落形態，立體顯微鏡20×觀察真菌生長情況，100×觀察辨認分生孢子，記錄每平板中感染種子數，同時挑取單個菌落進行PDA分離純化培養，獲得純菌株后PDA試管保存。

1.3.2 紙培養法 每個培養皿中放入2張滅菌濾紙，加入無菌水約10mL備用。檢測方法同PDA平板法。

1.4 真菌鑒定

PDA平板法和紙培養法培養時將分離到的真菌分別進行純化、鏡檢和轉管保存。根據培養性狀和形態特征，參照《真菌鑒定手冊》[16]進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 種子帶菌檢測結果

2.1.1 種子外部帶菌結果 種子外部帶菌率 PDA培養法（32.11%～46.07%）稍高于紙培養法（22.47%～45.38%），種子外部攜帶的優勢菌群主要為青霉屬（Penicillium spp.）、曲霉屬（Aspergillus spp.）、根霉屬（Rhizopus sp.），分離頻率分別為43.90%～75.07%、2.44%～21.2%、2.44%～10.15%。此外，還有鐮刀菌屬（Fusariumspp.）、鏈格孢屬（Alternaria spp.）、木霉屬（Trichoderma sp.）和毛霉屬（Mucorsp.）。對比不同地區，撫松縣種子外部帶菌率比左家鎮低13%左右。見表1。

2.2 北五味子種苗帶菌檢測結果

表1 北五味子種子外部分離真菌及分離頻率Table 1 Genera and proportions of fungi isolated from S.chinensis seed suface

2.1.2 種子內部帶菌結果 種子內部分離頻率最高的是青霉屬，分離頻率為25.00%～71.42%。檢驗方法不同，實驗結果有差異。與紙培養法相比，PDA法檢測出的真菌種類多，共檢出青霉屬、鐮刀菌屬、鏈格孢屬、木霉屬、葡萄孢屬（Botrytisspp.）、毛霉屬和曲霉屬8種，紙培養法沒有檢測到葡萄孢屬和毛霉屬。

種子內部帶菌率在地區間有差異，整粒種子、種殼和種仁的帶菌率撫松縣均較高，整粒種子為11.15%～12.50%、種 殼 為 9.38%～9.56%、種 仁 為8.16%～15.00%；左家鎮樣品整粒種子為7.87%～9.09%、種殼為6.09%～9.38%、種仁為6.56%～7.30%。

表2 北五味子種子內部真菌及分離頻率Table 2 Genera and frequenceies of fungi isolated from inside seed

采用 PDA平板法檢測的種苗帶菌率為53.33%～76.11%，明顯高于紙培養法（13.67%～20.19%），檢出真菌主要有鏈格孢屬（帶菌率37.28%～60.22%）、鐮刀菌屬（帶菌率7.12%～22.35%）、木霉屬（帶菌率3.76%～14.24%），其次，還有毛殼菌屬（Chaetomium spp.）、柱孢屬（Cylindrocarpom spp.）、彎孢屬（Curvularia spp.）、曲霉屬、青霉屬。PDA平板法檢測出了紙培養法沒有檢出的彎孢屬。結果見表3。

3 結論與討論

表3 北五味子種苗真菌及分離頻率Table 3 Genera and frequenceies of fungi isolated from inside seedling

3.1 對來自撫松縣、左家鎮的8份北五味子種子進行帶菌檢測，實驗結果表明，北五味子種子外部帶菌率為22.47%～46.07%，明顯高于內部帶菌率（4.69%～12.50%），但是種子內部攜帶真菌種類多。

3.2 對來自撫松縣和左家鎮兩個地區10份種苗資源進行帶菌檢測，種苗帶菌率明顯高于種子帶菌率，其中，鏈格孢屬分離頻率最高，其次是鐮刀菌屬。

3.3 五味子種苗攜帶柱孢屬真菌為首次報道，但尚未有柱孢屬真菌引起五味子病害的報道。柱孢屬真菌是一種常見的土壤習居菌，地理分布較廣，英國、美國、法國、中國、日本、韓國等很多國家均有柱孢屬真菌報道，柱孢屬真菌寄主范圍也很廣，分別隸屬于61科108屬，果苗、花卉及以根入藥的植物上其危害較大[17]。中國人參銹腐病4類致病銹腐菌為柱孢屬真菌，年平均發病率在20%～30%左右，在主要參區則高達70%～80%，嚴重影響了人參的質量和產量。K.A.Seifert等[18]用微管蛋白基因和rRNA基因內轉錄間隔區（ITS）序列方法測定北美西洋參根腐病菌株確定為Cylindrocarpon destructans。Traquair等[19]報道，C.destructans導致果蔬儲藏期的發霉和果樹冷藏期的腐爛，可見，柱孢屬真菌的危害很大。本試驗分離到柱孢屬菌株，還需要對其進行生物學特性和致病性等相關其他研究。

3.4 不同檢驗方法對實驗結果有影響，與紙培養法相比，PDA法檢測出的真菌種類多，更能反映出真實的種子、種苗帶菌情況。本實驗僅對吉林省2個產地北五味子種子、種苗攜帶的真菌種類及帶菌率進行了初步研究，而關于五味子種子、種苗健康檢驗工作還需要進一步開展。