加工番茄田列當致病菌的篩選與鑒定

何 偉，許建軍，楊 華，孫曉軍

(新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】列當是一類寄生在植物根部寄生生活的列當科(Orobanchaceae) 列當屬(OrobancheL.) 植物的總稱。列當寄主范圍非常廣泛，可寄生在豆科、十字花科、葫蘆科、亞麻科、茄科、菊 科、禾本科和大麻科等植物根上[1]。近年來新疆加工番茄受到列當嚴重危害，造成大量減產，遭受列當危害加工番茄減產30%～80%，嚴重時甚至絕產。列當已成為制約新疆加工番茄生產主要因素之一。篩選適宜本地自然環境的強致病性菌株可為列當生防菌提供菌株資源。研究將從新疆加工番茄田間自然發病列當上分離獲得致病性強的菌株，為新疆加工番茄列當生防菌提供菌種資源?！厩叭搜芯窟M展】利用致病菌防除列當多為鐮刀菌。如Thomas 等[2]報道的尖孢鐮刀菌[F.oxysporumf. sp.orthoceras(Appel & Wollenw.) Bilay]和Nemat Alla 等[3]報道尖孢鐮刀菌(F.oxysporumSchl.) Foxy I和Foxy II的孢子懸浮液分別對向日葵列當、鋸齒列當和分枝列當具有一定防治效果。而其他鐮刀菌包括彎角鐮刀菌(F.camptocerasWollenw.&Reink.)、厚垣鐮刀菌(F.chlamydosporumWollenw. & Reinking)[4]和輪狀鐮刀菌(F.verticillioidesNirenb.)[5]等也均具有防除列當的潛能。除鐮刀菌外，熒光假單胞菌(PseudomonasfluorescensFlügge)[6]、UlocladiumbotrytissPreuss.[7]和洋蔥曲霉[8]也具有類似的防除作用。國內研究者也從發病列當植株上分離獲得多種鐮刀菌菌株，如王之樾等[9]從新疆瓜列當獲得一個鐮刀菌并試制成“生防劑F798；孔令曉等[10]從向日葵列當上分離獲得的鐮刀菌L2菌株；丁麗麗等[11]從新疆瓜列當上分離的菌株中篩選出4個對列當高致病性菌株；柴阿麗等[12]從新疆加工番茄田采集列當病樣分離獲得銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)?！颈狙芯壳腥朦c】采用生防菌防治列當是當前研究熱點，研究篩選對加工番茄列當具有強致病力的菌株。【擬解決的關鍵問題】研究采集新疆加工番茄田間自然發病列當，組織分離獲得菌株，菌株發酵液和粗毒素提取液抑制列當種子萌芽及活體接種，篩選致病性強的菌株，采用形態學特征并輔以分子生物學方法鑒定。為加工番茄列當生防菌的開發應用提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

樣本：2016年加工番茄坐果期，在呼圖壁縣、昌吉市、吉木薩爾縣、和碩縣、焉耆縣和博湖縣等加工番茄田間采集自然發病列當植株。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8。

馬鈴薯葡萄糖培養基(PDB)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分離與純化

使用消毒剪刀將列當病健交界處剪成3～5 mm的小塊，將小塊在70%酒精中消毒1 min，轉移至3%次氯酸鈉溶液中消毒5 min，轉至PDA平板上。培養2～3 d后，挑取菌落邊緣菌絲轉移至新的PDA平板上。菌落長成后挑單孢進行純化，并試管保存菌株。

1.2.2 菌株發酵液和粗毒素提取液對列當種子萌芽抑制作用測定

(1)列當種子預處理

將列當種子在70%酒精消毒1.5 min后轉移至1%次氯酸鈉消毒12 min，晾干使用。

(2)菌株發酵液對列當種子萌芽抑制效果測定

將列當致病菌接入PDA培養培養基中，7 d后打孔4～5個轉入100 mL PDB液體培養基中，搖床培養7 d，26℃，160 r/min。將一張whatman濾紙(GA/A)置于培養皿中，用無菌水浸濕，將20粒列當種子置于濾紙上，每處理4次重復。在每個培養皿中依次加入5 mL GR24和5 mL發酵液，對照處理是5 mL GR24和5 mL滅菌水。在室溫25℃，遮光條件下培養7～10 d后，體式顯微鏡下觀察列當種子萌芽數量并記錄。

(3)菌株粗毒素的提取

將列當致病菌轉到PDA培養基中，待菌落長滿整個培養基，采用直徑0.6 cm打孔器打孔。用灼燒過的接種針挑取4～5片接種于裝有250 mL PDB液體培養基的三角瓶內，每個菌株接種兩瓶。置于恒溫搖床培養7 d(26℃，160 r/min)后取培養液15 mL離心10 min，轉速為10 000 r/min，取上清液，高壓滅菌后得到粗毒素提取液。

(4)菌株粗毒素提取液對列當種子萌芽抑制效果測定

將20粒列當種子中置于Whatman玻璃濾紙(GA/A)，加入5 mL GR24和5 mL菌株粗毒素提取液，每個菌株3次重復，空白對照為5 mL GR24和5 mL滅菌水。在室溫25℃，遮光條件下培養7～10 d后，體式顯微鏡下觀察列當種子萌芽數量并記錄。將抑制列當種子萌芽抑制效果高的菌株粗毒素提取液稀釋500和1 000倍進行實驗，方法同上。

1.2.3 盆栽試驗

(1)菌株致病性測定

盆栽試驗采取以下三種方式進行接種，接種菌株孢子懸浮液濃度在106～107個孢子/mL(每200 mL中滴兩滴Tween20)。

針刺法：每株列當分三段，莖基部、莖中部、莖頂端，用無菌牙簽沾取菌液(無菌水稀釋過的)，針刺列當植株，傷口用濕潤的脫脂棉覆蓋保濕24 h后摘下。

涂抹法：每株列當分三段，莖基部、莖中部、莖頂端，用無菌牙簽挑取菌絲，涂抹列當植株，涂抹的地方用濕潤的脫脂棉覆蓋保濕24 h后摘下。

噴霧法：用無菌水稀釋過的菌液倒入噴壺中，噴灑剛出土的列當，最后整株列當用地膜覆蓋保濕24 h后摘下?？瞻讓φ諡榍逅幚怼＝臃N3 d后觀察列當病情并記錄。

(2)菌株孢子懸浮液對列當出土抑制作用測定

選擇對列當植株致病性較強的菌株進行孢子懸浮液對盆栽列當防治效果實驗，將土壤高溫消毒后裝盆，每盆裝約3.2 kg，將50 mg列當種子與土混勻后撒播與番茄苗根部。將30 d苗齡的番茄苗移入盆中，每盆一株苗，每盆澆灌200 mL菌懸液，每菌株4次重復，空白對照澆灌清水。孢子懸浮液濃度在106～107個孢子/mL。15 d后調查列當出土數量并計算抑制效果。

1.2.4 菌株鑒定

(1)形態學鑒定

將從列當致病植株上分離得到的菌株接種于PSA培養基上，培養7 d后觀察菌落形態和產生色素情況。在PSA上25℃培養4 d后測量菌落生長直徑。大型和小型分生孢子形態、厚垣孢子形態以及分生孢子梗形態培養11 d后觀察大型孢子分生孢子大小、形態、分隔數以及小型分生孢子的大小、形態，并觀察厚垣孢子的形態和大小以及分生孢子梗形態。

(2)分子生物學鑒定

采用真菌DNA試劑盒提取菌株DNA基因組，引物為真菌通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，真菌DNA提取試劑盒與引物合成均為北京鼎國昌盛生物科技有限公司。反應體系為50 μL，其中2XMix 25 μL、ITS1 (10 μM) 1 μL、ITS4 (10 μM)1 μL、DNA模板2 μL，ddH2O加至50 μL。反應條件，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸50 s，72℃延伸10 min，35cycles。PCR產物回收，2.0%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片斷，加入回收試劑溶液A 300 μL/0.1 g，60℃水浴至膠完全溶化，加入50 μL回收試劑溶液B，混勻 ，將溶液置于離心柱中，靜置5 min，12 000 r/m，1 min，棄液體，加入500 μL 80%乙醇，12 000 r/m，離心1 min，棄液體，重復一次，12 000 r/m，離心5 min，甩干余液，棄液體，晾干5～8 min，將離心柱置于新的離心管中，加入30 μL滅菌雙蒸水，靜置10 min，13 000 r/m，離心3 min，管底即為純化產物。純化產物在北京鼎國昌盛生物科技有限公司進行測序。以NCBI數據庫中的Blast程序比對分析，采用MEGA6.0軟件中鄰接法進行聚類分析鑒定。

2 結果與分析

2.1 列當致病菌的分離與純化

加工番茄田間采集自然發病寄生性雜草列當106株典型病樣，帶回實驗室采用常規組織分離，共計獲得60個菌株。

2.2 分離菌株發酵液對列當種子萌發抑制作用

研究表明，菌株發酵液對列當種子萌芽抑制效果最好的菌株為2016-22和2016-51，抑制效果均為100%，其次是菌株2016-26、2016-44、2017-6，抑制效果分別為92.86%、90.48%、92.86%。表1

表1 不同菌株發酵液對列當種子萌芽抑制效果比較

Table 1 Comparison of inhibition effect of different strains fermented liquid to broomrape seed germination

菌株編號Strain number萌發率(%)Germination rate抑制率(%)Inhibition rate抑制效果(%)Inhibition effect2016-150.0050.0028.57a2016-516.6783.3376.192016-836.6763.3347.62bc2016-1025.0075.0064.29de2016-1335.0065.0050.00c2016-1435.0065.0050.00c2016-1721.6778.3369.05ef2016-220100100i2016-265.0095.0092.86hi2016-2730.0070.0057.14cd2016-2813.3386.6780.95g2016-2911.6788.3383.33g2016-3618.3381.6773.81fg2016-3710.0090.0085.71gh2016-4213.3386.6780.95g2016-4336.6763.3347.62bc2016-446.6793.3390.48h2016-4618.3381.6773.81fg2016-4915.0085.0078.57g2016-510100.00100i2016-5525.0075.0064.29de2017-65.0095.0092.86hiCK70.0030.00

注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05

Note：The different small letters represent significant difference at 5% level

2.3 菌株粗毒素提取液對列當種子萌芽抑制作用

研究表明，2016-14、2016-27、2016-28、2016-36、2016-37、2016-42、2016-46等8個菌株粗毒素提取液對列當種子的萌發抑制效果達到100%。2016-17、2016-22、2016-44、2016-51、2016-55、2017-6等6個菌株粗毒素提取液對列當種子的萌芽抑制效果均在90%以上，分別為95.24%、96.83%、96.83%、95.24%、92.06%、92.06%。在500倍粗毒素提取液濃度下，2016-14、2016-27、2016-42、2016-46等4個菌株粗毒素提取液對列當的萌發抑制效果均在40%以上，分別為40.48%、45.24%、59.52%、42.86%。在1 000倍粗毒素濃度下，2016-27、2016-42、2016-46、2016-51等4個菌株粗毒素提取液對列當的萌發抑制效果分別為2.38%、7.14%、4.76%、2.38%，其余菌株對列當種子無抑制效果。表2

表2 不同菌株粗毒素提取液對列當種子萌芽抑制效果比較

Table 2 Comparison inhibition effect of different strains of crude toxin extract to broomrape seed germination

菌株母液 Mother liquor500倍 500 times1 000倍 1,000 times抑制率(%)Inhibition rate抑制效果(%)Inhibition effect抑制率(%)Inhibition rate抑制效果(%)Inhibition effect抑制率(%)Inhibition rate抑制效果(%)Inhibition effect2016-193.3389.47bc2016-591.6786.84b2016-891.6786.84b2016-1085.0076.32a2016-1388.3381.58ab2016-14100100d58.3340.48gh30.0002016-1796.6794.74c48.3326.19e30.0002016-2298.3397.37cd53.3333.33ef30.0002016-2691.6786.84b2016-27100100d61.6745.24h31.672.382016-28100100d41.6716.67d30.0002016-2988.3381.58ab2016-36100100d36.679.52c30.0002016-37100100d51.6730.95ef30.0002016-42100100d71.6759.52i35.007.142016-4386.6778.95a2016-4498.3397.37cd30.000a30.0002016-46100100d60.0042.86h33.334.762016-4988.3381.58ab2016-5196.6794.74c55.0035.71fg31.672.382016-5595.0092.11c35.007.14bc30.0002017-695.0092.11c33.334.76b30.000CK36.6730.0030.00

注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05

Note：The different small letters represent significant difference at 5% level

2.4 不同接種方式菌株對列當致病性

研究表明，供試的7個菌株針刺法都可引起列當明顯發病。其中菌株2016-14、2016-36接種3 d后即發病并迅速引起萎蔫、腐爛和莖基部褐變，接種7 d后整株腐爛，死亡。在涂抹法中，菌株2016-36、2016-42和2017-6對列當的侵染性最強，接種3 d表現明顯發病，接種7 d后整株腐爛，死亡。在噴灑霧中，菌株2016-42和2017-6的致病效果最好，接種3 d后發病，7 d后整株腐爛，死亡。采用針刺、涂抹和噴霧等3種接種方式進行接種，不同菌株在不同接種方式下，發病情況具有明顯差異。表3，圖1

表3 不同接種方式菌株致病性比較

Table 3 Comparison of pathogenic of strains by different ways of inoculation

菌株編號Strain number針刺接種Acupuncture inoculation涂抹接種Daub inoculation噴霧接種Spray inoculation2016-14傷口變褐,整株萎蔫,變腐死亡莖基部變褐無癥狀2016-27傷口及周圍變褐傷口及周圍變褐無癥狀2016-28傷口及周圍變褐,整株萎蔫傷口及周圍變褐無癥狀2016-29傷口變褐無癥狀無癥狀2016-36傷口變褐,整株萎蔫,變腐死亡傷口變褐,整株萎蔫,變腐死亡輕微褐變2016-42傷口及周圍變褐莖基部變褐,整株變腐死亡莖基部變褐,整株變腐死亡2017-6傷口變褐,整株萎蔫,變腐死亡整株萎蔫死亡整株萎蔫死亡

A：針刺接種；B：噴霧接種；C：涂抹接種；D空白對照

A：Acupuncture inoculation；B：Spray inoculation；C：Daub inoculation；D：CK

圖1 菌株2016-42不同接種方式下列當發病情況

Fig.1 The infection situation of Broomrape use different inoculation by Strain 2016-42

2.5 菌株孢子懸浮液對列當出土抑制作用

研究表明，供試的3個菌株中，菌株2016-36和2016-42孢子懸浮液處理列當出土時間最早，較空白對照提前10 d，菌株2017-6孢子懸浮液列當出土時間最晚，較空白對照延遲22 d。3個菌株孢子懸浮液處理列當出土抑制效果具有顯著差異，菌株2017-6孢子懸浮液對列當出土抑制效果最好，抑制效果為94.65%，其次是菌株2016-42，抑制效果為25.05%，菌株2016-36最低，抑制效果為19.70%。表4

表4 不同菌株孢子懸浮液對列當出土抑制效果比較

Table 4 Comparison of broomrape inhibition effect of different strains spore suspension

菌株Strains平均單盆列當出土數量 The number average single basin unearthed broomrape (strain/pot)9月25日10月6日10月18日10月28日總計 Sum抑制效果(%)Inhibition effect2017-60000.250.2594.65b2016-361.2502.503.7519.70a2016-4211.251.2503.525.05aCK01.672.670.334.67

注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05

Note：The different small letters represent significant difference at 5% level

2.6 菌株鑒定

2.6.1 菌株形態學鑒定

菌株2017-6培養性狀：在 PSA上25℃、4 d的菌落直徑為3.0～4.5 cm。氣生菌絲白色，羊毛狀。形態特征：小型分生孢子數目多，橢圓形，腎形，0～1隔，大小(6.65～17.48) μm×(2.49～4.51) μm。大型分生孢紡錘形或鐮刀形，基胞足跟明顯，2～6分隔，多為2～3分隔，大小(3.50～4.51) μm×(17.41～39.46) μm。分生孢子梗長，單瓶梗，厚垣孢子頂生或串生。根據上述培養性狀和形態特征，參考王拱辰等的《常見鐮刀菌鑒定指南》[13]，將菌株2017-6鑒定為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum。

2.6.2 菌株18S rDNA的ITS序列分析

通過GenBank中進行Blast比對，應用MEGA6.0軟件中鄰接法構建聚類分析樹狀圖，bootstrap檢驗值≥50%，1 000次重復。基于數據庫中18個菌株的ITS序列，采用鄰接法構建系統發育樹，以確證菌株2017-6的分類歸屬。菌株2017-6與菌株KF751873.1Fusariumoxysporum在同一分支上，且兩個菌株ITS序列相似性為99%，這與形態學鑒定結果一致。圖2

圖2 菌株2017-6的系統發育樹狀圖

Fig.2 The phylogenetic tree of strain 2017-6

3 討 論

目前提出的防除列當的措施主要包括人工拔除、化學防除、農藝措施、培育抗性品種和昆蟲防除等[14]，但上述措施生產上應用存在缺陷，很難有效控制列當為害，因此,篩選對列當致病使其自然死亡的致病菌作為生防因子已成為研究熱點。國內外已有很多關于從微生物防除列當的報道，主要有鐮刀菌(Fusariumspp.)[15]、根瘤菌[16]、叢枝菌根真菌[17]和假單胞桿菌[18]等。已報道的從列當植株上分離獲得的致病菌多為鐮刀菌。研究中篩選出的菌株為鐮刀菌，但由于鐮刀菌中的許多種為多種植物病害的致病菌，因此，此類病原菌在使列當致病的同時也可能對寄主或其他農作物造成危害。要開發出對加工番茄安全且對列當高度致病的生防菌劑，還需要對已篩選菌株的寄主范圍、安全使用濃度以及使用方法等做進一步的研究。

列當種子萌芽至寄生在寄主根部階段是防治列當最佳時期[19]。研究中鐮刀菌菌株發酵液對列當種子萌芽抑制效果較菌株粗毒素提取液差，菌株粗毒素提取液隨著稀釋倍數增加對列當種子萌芽抑制效果降低，當稀釋倍數達到1 000倍時，菌株粗毒素提取液對列當種子萌芽無抑制效果。采用濃縮或添加助劑提高菌株毒素對列當種子萌芽抑制效果可作為進一步研究方向。

土壤中存在多種對植物土傳病害有防治作用的有益微生物，而寄主植物對列當的抗性機理與植物對病原菌的抗性機理十分類似，因此,有益土壤微生物可能也可以防除列當[14]。此外，與從列當植株上分離的微生物相比，分離自土壤中微生物易在土壤中存活繁殖，且能夠在列當種子萌芽和侵染寄主時發揮作用，因此，從該地加工番茄田間發病列當植株根際土壤中分離防除列當微生物可作為篩選列當生防菌的一個研究方向。

國內研究者從不同區域多種列當上分離獲得對列當植株致病性強的菌株[10-13]，但未見菌株孢子懸浮液對列當出土抑制效果的報道。研究篩選的菌株對列當出土具有較好抑制效果，但其作用機理、土壤中定殖能力及其與土壤中微生物群落相互作用需要進一步深入研究。

4 結 論

篩選出的菌株2017-6粗毒素提取液對列當種子萌芽抑制效果在90%以上，其孢子懸浮液對列當植株具有強致病性。目前，多數列當生防菌均是在列當出土后進行防治，此時作物已經遭受危害，且由于列當出土多在作物生育中后期，不易被發現，防治較為困難。菌株2017-6孢子懸浮液對列當出土抑制效果達94.65%，且可有效延緩列當出土時間。