PDGF—BB對UVB誘導的光老化成纖維細胞中ROS的影響

任潤健 方磊 賈傳龍 趙虎 陳亮 秦登科 周慧敏 畢波

[摘要]目的：探討PDGF-BB對紫外線誘導的光老化成纖維細胞中ROS的影響及抑制氧化應激的作用特點。方法：利用CCK-8法檢查不同濃度PDGF-BB對成纖維細胞增殖活性的影響，篩選治療最佳濃度；PDGF-BB預處理成纖維細胞48h后，利用UVB體外重復照射構建成纖維細胞光老化模型；利用β-半乳糖苷酶染色法檢測細胞衰老程度；裝載活性氧（ROS）檢測探針，利用熒光顯微鏡、流式細胞技術觀察和檢測各組ROS的表達。結果：PDGF-BB預處理輻照組（UVB+PDGF-BB組）中β-半乳糖苷酶染色細胞的著色比率低于UVB組，差異有統計學意義（P<0.05）。在UVB誘導的應激性老化中，UVB組ROS表達顯著高于正常組（P<0.05）；PDGF-BB預處理輻照組（UVB+PDGF-BB組）ROS表達顯著低于UVB組（P<0.05）。結論：PDGF-BB可降低UVB介導的光老化成纖維細胞中ROS的表達，減少氧化應激反應，可在一定程度上緩解光老化進程。

[關鍵詞]光老化；PDGF-BB；成纖維細胞；ROS；UVB

[中圖分類號]R758.1 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）05-0109-03

Effect of PDGF-BB on Reactive Oxygen Species in UVB-induced Skin Fibroblasts

REN Run-jian1，FANG Lei1，JIA Chuan-long2，ZHAO Hu1，CHEN Liang2，QIN Deng-ke2，ZHOU Hui-min1，BI Bo1

（1.Department of Clinical Laboratory Medicine；2.Department of Plastic and Aesthetic Surgery，Huadong Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai 200040，China）

Abstract： Objective To explore the effect of PDGF-BB on reactive oxygen species （ROS） in UVB-induced skin fibroblasts and the characteristics of oxidative stress. Methods The effect of PDGF-BB of different dosages on the activity of fibroblasts was detected by CCK-8 assay. After pretreatment of fibroblast 48h with PDGF-BB， the photoaging model was successfully established with UVB in vitro. The senescence degree of cells was detected by the β-galactosidase staining method. ROS test probe was loaded and oxidative stress of fibroblasts was induced by UVB irradiation in vitro and the expression of ROS was measured by fluorescence microscopy and flow cell technology respectively. Results The coloring percentage of the cells stained by beta galactosidase in the PDGF-BB pretreatment group（UVB+PDGF-BB group） was lower than that in the UVB group， the difference was statistically significant（P<0.05）. In UVB induced stress aging， the expression of ROS in UVB group was significantly higher than that in normal group（P<0.05）. The expression of ROS in the PDGF-BB pretreatment group （UVB+PDGF-BB group） was significantly lower than that of UVB group（P<0.05）. Conclusion PDGF-BB can reduce ROS expression in fibroblasts induced by UVB irradiation and decrease oxidative stress， and it could alleviate photoaging in some extent.

Key words： photoaging； platelet derived growth factor BB（PDGF-BB）； fibroblasts； reactive oxygen species（ROS）； ultraviolet radiation B（UVB）

皮膚光老化作為皮膚老化的重要組成部分，嚴重影響人們的外觀和身體健康[1-2]。在其發生發展進程中，紫外線，尤其是波長范圍290～320nm的中波紫外線（Ultraviolet radiation B， UVB）成為主要誘因[3]。UVB引起的皮膚光老化主要表現為彈性缺失，皺紋加深，色素沉著，甚至誘發黑色素瘤等[4]。在這一復雜病理生理過程中，成纖維細胞（Fibroblasts， FBs）受到損傷，出現一系列衰老表型，如細胞肥大鋪展，β-半乳糖苷酶染色陽性，細胞周期阻滯等。有研究認為UVB誘導活性氧（Reactive oxygen species， ROS）的異常生成，光子能量轉化為化學能量所造成的氧化應激是導致光老化的主要機制。血小板衍生因子（Platelet derived growth factor， PDGF）是由兩條多肽鏈組成的二聚體，相對分子質量為28～35KD，主要由成熟的血小板分泌，存在于多種組織中如血小板、骨骼肌細胞、內皮細胞、成骨細胞，是一種促有絲分裂刺激源[5]。同時，PDGF有很強的趨化作用，對骨骼肌細胞、未分化間充質細胞、單核細胞等都有很強的趨化功能。近來有研究發現在星形膠質細胞中，PDGF-BB可抑制自由基活性氧（ROS）產生，保護線粒體超微結構對抗氧化應激，從而發揮其保護作用[6]。然而，PDGF-BB能否改善UVB造成的氧化應激，從而延緩光老化進程尚不清楚。本研究應用此前在體外建立的成纖維細胞光老化模型（Stress-induced premature senescence， SIPS），予以外源性PDGF-BB處理，觀察其對SIPS-FBs的生物學作用。

1 材料和方法

1.1 小鼠皮膚細胞的獲取：取1～3d新生SPF級C57 BL/6小鼠，乙醚麻醉后浸泡于75%乙醇中8～10min，用滅菌PBS洗去殘留乙醇，無菌條件下分離其背部皮膚，留取1cm×1cm皮膚組織，立即置于2%中性蛋白酶中，密封，4℃冰箱過夜；將皮膚取出后分離表皮與真皮，剪碎真皮，置于0.1%膠原酶中，37℃恒溫搖床消化2h，待組織團塊基本消失可離心，1 500r/min離心5min，收集沉淀；棄去上清，用DMEM+10% FBS制成細胞懸液，吹打均勻后以約2×105/cm2密度接種于培養皿置于常規培養箱中培養；待2～3d后，細胞近80%～90%融合時進行傳代，比例約為1：4。

1.2 藥物預處理及光老化模型的建立：選用P1代細胞，首先利用含不同PDGF-BB濃度DMEM+10% FBS處理約48h。本研究中，成纖維細胞隨機分為4組：正常組（無PDGF-BB預處理，無UVB輻照），PDGF-BB組（PDGF-BB預處理，無UVB輻照），UVB組（無PDGF-BB預處理，UVB輻照），UVB+PDGF-BB組（PDGF-BB預處理，UVB輻照）。隨后依據相關文獻方法[7]，棄去培養液，覆蓋薄層PBS緩沖液，置于UVB燈管（Philips TL 20W/01RS lamp）正下方，打開蓋子，進行輻照，照射劑量為120mJ/cm2。輻照完畢后，除去PBS，加入5ml DMEM+1% FBS繼續培養，間隔12h照射1次，120s/次，共4次；末次輻照完成后改用DMEM+10% FBS繼續培養。

1.3 β-半乳糖苷酶染色：將生長于6孔板中的成纖維細胞吸除培養基，用PBS洗滌后加入1ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫下固定15min。吸掉固定液，用滅菌PBS洗滌3次，加1ml工作液（現用現配），利用鹽酸及氫氧化鈉調整pH至6[8]。37℃孵育過夜。普通光學顯微鏡下觀察到胞質呈藍色者為陽性細胞，表示細胞處于衰老狀態。陽性率的計算方法為200倍下隨機取10個視野，計算陽性細胞占總細胞數的百分比。

1.4 檢測細胞ROS生成：按照DCFH2-DA：DMEM-free serum配比1：1 000制備試劑，加入6孔板中1ml/孔，置于培養箱中37℃孵育20～30min。吸掉培養液，無血清DMEM洗滌3次后，薄層PBS覆蓋細胞，置于UVB燈管下，照射1次，劑量為120mJ/cm2，2min后棄去PBS，加入無血清DMEM培養基，30min后置于熒光顯微鏡下觀察，同樣的藥物處理及輻照后即刻用0.25%胰酶消化細胞，流式細胞儀檢測ROS表達。

1.5 統計學分析：采用統計分析軟件SPSS 13.0分析結果，所有數據以均數±標準差表示，各組間的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PDGF-BB實驗濃度的篩選：使用梯度PDGF-BB濃度的DMEM+10% FBS處理小鼠成纖維細胞，0～8ng/ml PDGF-BB對成纖維細胞活性無影響，且有不同程度促進作用，尤以1ng/ml顯著。因此，本次選擇1ng/ml的PDGF-BB作為后續細胞處理的藥物濃度（見圖1）。

2.2 β-半乳糖苷酶染色結果：正常組和PDGF-BB組細胞鮮有染色；UVB組衰老染色主要集中在細胞核周，呈藍綠色；經過PDGF-BB預處理的輻照組（UVB+PDGF-BB組）中陽性染色的細胞顯著減少（見圖2），差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 細胞ROS生成檢測結果：UVB可導致ROS一過性升高，峰值出現在照射后30min左右。共聚焦熒光顯微鏡下觀察可見，經UVB組細胞的熒光強度強于正常組；與UVB組相比，經過PDGF-BB預處理的輻照組（UVB+PDGF-BB組）中熒光強度明顯下降（見圖3）。流式細胞儀檢測分析顯示，與UVB組相比，經過PDGF-BB預處理的輻照組（UVB+PDGF-BB組）中的相對熒光強度的波峰向左回移，ROS水平明顯下降（見圖4）。

3 討論

活性氧（ROS）是生物體內的氧通過單電子還原產生的化學性質活潑物質，包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子自由基（O2·-）、和羥基自由基（·OH）等[9]。低濃度的ROS有助于細胞生理活動的調節，而過量的ROS可氧化脂質、蛋白質等大分子，激活炎性信號通路甚至導致細胞凋亡或變性壞死[3]。ROS半衰期很短，可與DNA、蛋白質和脂質相互作用，造成DNA鏈斷裂和氧化性損傷、蛋白-蛋白交聯、蛋白-DNA交聯和脂質過氧化等，與癌癥、衰老、心血管疾病等疾病密切相關[10]。因此，抑制ROS過表達，維持氧化/還原平衡成為生命科學領域的一項重要課題[11]。

在成纖維細胞光老化模型中，經UVB反復照射，成纖維細胞內氧化還原系統失衡，即反復ROS過量產生，大量消耗細胞內還原物質，最終形成累積性的氧化損傷。有研究表明，細胞內90%的ROS由線粒體產生，而線粒體本身又極易受到氧化攻擊，發生線粒體DNA（mtDNA）突變、膜電位下降、膜完整性缺失等，從而形成了惡性循環，加重氧化應激，加速衰老[12]；ROS的聚集亦可誘導DNA氧化破壞與交聯，引起復制錯誤，破壞核苷酸輔酶以及滅活含巰基酶，繼而引發轉錄水平的改變[13]；ROS過表達不利于細胞外基質（Extracellular matrix， ECM）穩態的維持，ROS可激活多種信號通路，抑制酪氨酸磷酸酶，激活多個受體，導致下游的分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases， MAPK）、p38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）等活化[14]，使得核內轉錄因子AP-1 （Activator protein 1， AP-1）的表達增多，抑制I型膠原前體表達，加強基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases， MMPs）表達，造成ECM相關蛋白分泌減少，破環ECM穩態。而ECM對皮膚膚質好壞具有決定性作用[15]。

PDGF-BB是PDGF家族中活性最強的亞型，可與所有的受體分子（α-受體，β-受體）相結合，與跨膜酪氨酸激酶受體結合后可誘導許多其他細胞內蛋白的酪氨酸磷酸化，介導成纖維細胞趨化、增殖和誘導細胞外基質和基質金屬蛋白酶，參與創傷修復、肌腱重塑、潰瘍愈合等[16]。PDGF-BB可誘導特異性的生物反應，包括細胞增殖、遷移、基質合成、血管生成和生長因子的釋放。其在皮膚愈合，慢性潰瘍，肌腱修復，骨折及創傷中的研究和應用逐漸加深和普及。近年來，有研究表明，PDGF-BB具有線粒體保護作用。ROS產生與清除失衡后，線粒體膜電位下降，線粒體DNA突變，電子鏈傳遞和正常氧化磷酸化受到干擾，ATP生成減少，細胞走向衰老和凋亡。有研究證實PDGF-BB可通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B （Phosphatidylinositol 3 kinase /protein kinase B，PI3K/AKt）信號保護線粒體超微結構，緩解氧化應激。另外PDGF-BB可誘導抗氧化物酶如過氧化氫酶（Catalase，CAT），超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase2，SOD2），谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase 1，GPX1）的產生，有助于清除ROS，恢復細胞氧化/還原平衡[6]。本研究探討PDGF-BB可否減少UVB誘導的FBs內ROS過表達。實驗結果表明，1ng/ml PDGF-BB可有效減少ROS含量，提示其對UVB導致的氧化應激有的一定的拮抗作用。

綜上所述，本實驗證實了PDGF-BB可減少衰老染色陽性細胞，降低光老化成纖維細胞中ROS過表達，減輕UVB誘導的氧化應激從而緩解UVB對成纖維細胞的損傷。提示PDGF-BB可在一定程度上減緩光老化進程。然而，其對ROS表達抑制的具體機制及對成纖維細胞其他方面的影響，包括細胞周期、胞外基質平衡等需進一步研究。

[參考文獻]

[1]俞卓偉，保志軍，阮清偉，等.維持抗氧化、抗炎功能穩定與自身穩態和保健延壽[J].老年醫學與保健，2015，21（1）：1-4.

[2]李春雨，張麗宏，張寧，等.紫外線誘導皮膚光老化的形成機制[J].中國美容醫學，2009，18（3）：416-419.

[3]Pandel R，Poljsak B，Godic A，et al.Skin photoaging and the role of antioxidants in its prevention[J].ISRN Dermatol，2013，2013：930164.

[4]Zouboulis CC，Makrantonaki E.Clinical aspects and molecular diagnostics of skin aging[J].Clin Dermatol，2011，29（1）：3-14.

[5]Fredriksson L，Li H，Eriksson U.The PDGF family： four gene products form five dimeric isoforms[J].Cytokine Growth Factor Rev，2004，15（4）：197-204.

[6]Cabezas R，Vega-Vela NE，González-Sanmiguel J，et al.PDGF-BB Preserves Mitochondrial Morphology， Attenuates ROS Production， and Upregulates Neuroglobin in an Astrocytic Model Under Rotenone Insult[J].Mol Neurobiol，2018，55（4）：3085-3095.

[7]Zeng JP，Bi B，Chen L，et al.Repeated exposure of mouse dermal fibroblasts at a sub-cytotoxic dose of UVB leads to premature senescence： A robust model of cellular photoaging[J].J Dermatol Sci，2014，73（1）：49-56.

[8]陳亮，畢波，曾繼平，等.pH對衰老相關β-半乳糖苷酶染色的影響[J].中國美容整形外科雜志，2014，25（12）：751-754.

[9]Li L，Tan J，Miao Y，et al.ROS and Autophagy： Interactions and Molecular Regulatory Mechanisms[J].Cell Mol Neurobiol，2015，35（5）：615-621.

[10]崔劍，李兆隴，洪嘯吟.自由基生物抗氧化與疾病[J].清華大學學報（自然科學版），2000，40（6）：9-12.

[11]Pryor WA，Houk KN，Foote CS，et al.Free radical biology and medicine： it's a gas， man！[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2006，291（3）：R491-511.

[12]Balaban RS，Nemoto S，Finkel T.Mitochondria， Oxidants， and Aging[J]. Cell，2005，120（4）：483-495.

[13]Suzuki N，Mittler R.Reactive oxygen species-dependent wound responses in animals and plants[J].Free Radic Biol Med，2012，53（12）：2269-2276.

[14]Baxter PS，Hardingham GE.Adaptive regulation of the brains antioxidant defences by neurons and astrocytes[J].Free Radic Biol Med，2016，100：147-152.

[15]Tobin DJ.Introduction to skin aging[J].J Tissue Viability，2017，26（1）：37-46.

[16]Digiovanni CW，Lin S，Pinzur M.Recombinant human PDGF-BB in foot and ankle fusion[J].Expert Rev Med Devices，2012，9（2）：111-122.

[收稿日期]2018-03-12 [修回日期]2018-04-17

編輯/朱婉蓉