Caspase—7蛋白在中耳膽脂瘤中的表達及意義

王江 楊琳紅 魏曉麗

【摘要】 目的：探討Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤的發生、發展中的作用，為中耳膽脂瘤的臨床診斷、治療及預后提供新途徑。方法：收集2016年12月-2017年7月佳木斯大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科經病理科證實的術中標本45例。其中中耳膽脂瘤標本30例為試驗組，正常外耳道皮膚組織15例為對照組。采用免疫組化SP法分別檢測兩組中Caspase-7蛋白的表達情況。結果：Caspase-7蛋白在試驗組的陽性表達要明顯高于對照組，差異有統計學意義（字2=4.727，P<0.05）。結論：在中耳膽脂瘤上皮組織中Caspase-7蛋白呈高表達趨勢，其陽性表達率顯著高于正常外耳道皮膚組織，提示Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤的發生發展中起到重要作用。

【關鍵詞】 Caspase-7； 中耳膽脂瘤； 增殖； 凋亡； 免疫組織化學

【Abstract】 Objective：To explore the roles of Caspase-7 in the progression and development of cholesteatoma of middle ear，then to provide a new approach for the clinical diagnosis，treatment and prognosis of this disease.Method：A total of of 30 epithelial tissues of cholesteatoma of middle ear（the experimental group）and 15 normal epithelial tissues of external auditory canal（the control group）were collected from otolaryngological department of the First Affiliated Hospital of Jiamusi University from December 2016 and July 2017.SP approach of immunohistochemistry was used to examine the expression of two groups.Result：The positive expression rate of Caspase-7 in the experimental group was higher than that in the control group，the difference was statistically significant（字2=4.727，P<0.05）.Conclusion：Caspase-7 is showed high expression trend in epithelial tissues of cholesteatoma of middle ear.And the positive expression rate is significantly higher than the normal epithelial tissues of external auditory canal，suggesting that Caspase-7 plays an important role in the occurrences and developments of the cholesteatoma of middle ear.

【Key words】 Caspase-7； Cholesteatoma of middle ear； Proliferation； Apoptosis；

Immunohistochemistry

First-authors address：Jiamusi University，Jiamusi 154007，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.15.021

中耳膽脂瘤是耳科的一種常見疾病，也是一種來自在顳骨鱗狀上皮角化異常形成的邊界清楚的良性囊性病變[1-2]。中耳膽脂瘤雖是良性病變，卻具有類似于腫瘤的特性：持續增殖性生長、破壞周圍骨質以及向周圍侵襲的能力。鱗狀上皮在慢性感染的情況下逐漸被破壞，再加上膽脂瘤基質酶活性的增加，提高了膽脂瘤的溶骨作用[3]。對于沒有及時治療的患者尤其是小兒患者，存在顱內并發癥甚至引起死亡的風險[4]。雖然人們對中耳膽脂瘤做了大量的研究，但是發病機制目前仍然不完全清楚。根據以往的研究提示凋亡途徑可能是其中一個重要因素。

Caspase-7 Cysteine aspartate specific protease 7（Caspase-7）是Caspase蛋白家族的重要成員，承擔著凋亡執行的重要任務，是凋亡通路中必不可少的因子之一。研究表明Caspase-7參與了多種組織中的凋亡過程[5]，在多種癌癥的發生發展中起到重要作用。目前國內外尚無對Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤中研究的報道。本次研究采用兔抗人CASP7多克隆抗體，應用免疫組化SP法，檢測Caspase-7蛋白在30例中耳膽脂瘤上皮組織和15例正常外耳道皮膚組織中的表達情況，并運用統計軟件分析Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤組織中的表達情況，揭示Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤的發生、發展中的作用，并深入探討中耳膽脂瘤與細胞凋亡之間的關系，為中耳膽脂瘤的臨床診斷、治療及預后提供新途徑，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年12月-2017年7月佳木斯大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科經病理科證實的術中標本45例。其中中耳膽脂瘤標本30例為試驗組，正常外耳道皮膚組織15例為對照組。男20例，女25例，年齡3～74歲，平均48.4歲。所有標本均來自乳突根治術及中耳探查術患者，術后2 h內將標本經10%的中性福爾馬林溶液固定，24 h后將浸潤在10%福爾馬林溶液的標本用石蠟固定包埋、冷凍，放置4 ℃恒溫冰箱中冷藏待用，實驗時將包埋石蠟切片每例連續切片3張，最后通過蘇木精-伊紅染色，并閱讀切片、記錄。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人CASP7多克隆抗體購買于生工生物工程（上海）股份有限公司。PV-8000-1二步法通用試劑盒（6 mL），ZLI-9018 DAB顯色試劑盒（3 mL），ZLI-9029抗體稀釋液（50 mL），ZLI-9062 PBS緩沖液粉末（pH 7.3）10袋/包，均購于北京中衫金橋生物技術有限公司。梯度酒精、蒸餾水、二甲苯、中性樹膠及蘇木精、過氧化物酶阻斷劑，免疫動物血清、SP免疫組化試劑盒、生物素標記的第二抗體、PBS枸櫞酸抗原修復緩沖液均由佳木斯大學附屬第一醫院病理科提供。

1.2.2 免疫組化 利用免疫組化（SP）四步法檢測中耳膽脂瘤組織與正常外耳道皮膚組織中Caspase-7與Bak蛋白的表達情況。將一抗兔抗人CASP7多克隆抗體按照1︰200的濃度進行稀釋，同時利用PBS枸櫞酸抗原修復緩沖液對標本組織進行酸修復，以PBS代替一抗做陰性對照。利用HE染色后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標與評價標準 所有切片全部采用雙盲法進行觀察與計數（以病理科兩位正高職稱醫師為準），避開組織切片的邊緣，選擇明顯強于背景著色處計數。每張病理切片至少在高倍鏡（SP×200）下觀察10個以上不重復的視野，繼而判斷細胞染色強度和細胞染色百分比率，并按照相關標準計分[6]。按照染色強度計分：未著色為0分；淡染者1分；中等染色為2分；強染色為3分。染色范圍按陽性細胞數所占百分數計分：無陽性細胞為0分，≤10%為1分，10%～25%為2分，25%～50%為3分，50%～75%為4分，>75%為5分。兩項得分結果相加后分為四級：0分（-）；1～2分（+）；3～4分（++）；5～6分（+++）。其中“-“為陰性表達，”+“為陽性表達。

1.4 統計學處理 應用SPSS 16.0軟件包對所得的實驗數據進行相關的統計學分析，本次研究中計數資料采用字2檢驗、而組間相關分析采用Spearman等級相關分析法。檢驗水準α=0.05。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

通過閱片發現，Caspase-7蛋白主要定位于胞漿中，其陽性信號為胞漿內黃色、棕黃色以及棕色顆粒狀物。通過比較發現，Caspase-7蛋白幾乎聚集在中耳膽脂瘤上皮的全層，較為密集，見圖1；而在正常外耳道皮膚組織中表達稀疏，強度較弱，見圖2。通過統計發現，試驗組陽性表達22例，陽性率為73.3%（22/30），其中強陽性（+++及以上）表達12例，強陽性率為40.0%（12/30）；而對照組中僅有6例陽性表達，陽性率為40.0%（6/15），且胞漿中陽性信號較為稀疏，無強陽性表達。通過統計學分析，Caspase-7蛋白在試驗組的陽性表達要明顯高于對照組，差異有統計學意義（字2=4.727，P<0.05），見表1。

3 討論

中耳膽脂瘤是一種來自在顳骨鱗狀上皮角化異常形成的邊界清楚的良性囊性病變[1-2]，其局部侵襲性生長可導致局部正常中耳結構被破壞[3]。鱗狀上皮在慢性感染的情況下逐漸被破壞，再加上膽脂瘤基質酶活性的增加，提高了膽脂瘤的溶骨作用[3]。由膽脂瘤進步骨侵蝕可導致永久性耳聾，前庭功能障礙，面癱，更致命的顱內并發癥[7]。

前體Caspase-7是由儲存在細胞質中的待組裝的303個氨基酸組成的同源二聚體[8]。這些同源二聚體是由位于中央的12股β片狀折疊及周圍的10股α螺旋組成的[9-10]。這種所謂的“開放α/β桶折疊”包括兩個相同的反平行排列的酶單位，每個單位各攜帶一個特殊的活性位點，每一個酶單位都是由一大一小兩個催化亞基（大小分別為20 kDa和11 kDa）組成，它們在Caspase-7酶原的接頭序列相互連接，而這種連接正好阻礙了活性位點的激活[11]。通過分別裂解Asp 198和Ser 199以及Ser 199和Ala 207之間的肽鍵來實現連接區域的斷裂，從而使得環形結構L2、L3和L4進行空間重組并形成活性位點和底物結合口袋[11]。活化后的Caspase-7會進一步誘導細胞凋亡。

大多數的研究表明Caspase-7在多種組織中參與了細胞凋亡的發生發展[5]，并與多種腫瘤的發生發展密切相關。Matalova等[12]在人第一磨牙原發性釉結（發生細胞凋亡的部位）檢測出活化的Caspase-7蛋白，同時在分化的成齒質細胞和釉母細胞中的非凋亡區域也檢測出Caspase-7蛋白。進一步的研究發現敲除小鼠Caspase-7基因后小鼠切牙釉質沉積量顯著減少[13]。Chaudhary等[14]通過研究發現Caspase-7在乳腺癌組織中的表達率顯著高于正常組織，并證實其是乳腺癌發生的重要因素之一。還有學者研究發現Caspase-7與中、高分化的口腔鱗狀細胞癌的發生密切相關[15]。下調或抑制Caspase-7蛋白的表達會不同程度地降低腫瘤細胞的增殖[16-17]。這些研究均提示Caspase-7蛋白在腫瘤組織的發生發展中發揮重要作用。

根據大量研究可將中耳膽脂瘤的發病機制分為五類：（1）內陷囊袋理論（縮回口袋理論）；（2）上皮侵襲或遷移理論（移植理論）；（3）鱗狀化生學說；（4）基底細胞增生（乳頭狀生長理論理論）；（5）黏膜牽引理論[18-19]。但是無論哪種學說都無法完美的解釋膽脂瘤的發病原因。目前學者們普遍認為在中耳膽脂瘤中凋亡水平和增殖水平都要顯著高于正常皮膚，這一結論早在20世紀90年代后期已由Kojima等[20]和Ergün等[21]證實。在此結論后的研究中不斷發現新的凋亡因子以及增殖通路在中耳膽脂瘤組織中高表達，這也表明了在中耳膽脂瘤組織中凋亡水平與增殖水平達到了一個“相對平衡”的狀態，阻礙了中耳膽脂瘤向惡性的方向發展。一方面中耳膽脂瘤組織增殖水平的提高，加快了膽脂瘤上皮細胞的分化與增殖，使膽脂瘤不斷生長并破壞周圍臨近正常組織。另一方面由于機體的“自我保護”機制的開啟，使得中耳膽脂瘤組織中眾多的凋亡因子被激活，從而激發了內源性及外源性凋亡通路的發生，使得過度增殖的膽脂瘤上皮發生凋亡，其結果就是大量“鱗屑樣物”的堆積，這也進一步促使了中耳膽脂瘤的生長。

Caspase蛋白家族是凋亡通路中不可或缺的因子，幾乎貫穿著凋亡通路的全過程。Caspase-7蛋白是Caspase蛋白家族中重要的效應因子，在凋亡通路的執行階段中起到決定性作用。在本研究中，通過免疫組化SP法處理了30例中耳膽脂瘤上皮組織與15例正常外耳道皮膚組織標本，發現在中耳膽脂瘤上皮組織標本中陽性表達率為73.3%（22/30），陽性信號幾乎覆蓋上皮全層，表達較為密集。而在15例正常外耳道皮膚組織中，陽性表達率僅為40%。通過此研究發現Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤上皮中的陽性表達率要高于正常外耳道皮膚組織（字2=4.727，P<0.05）。這一研究結果表明了Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤的發生發展過程中發揮了重要作用。同時也表明了中耳膽脂瘤上皮中的凋亡水平比正常組織要顯著提高，提示凋亡水平的提高也是膽脂瘤發生發展的一個不可或缺的因素，也讓我們對膽脂瘤的發病機制有了更深入的認識。

綜上所述，在中耳膽脂瘤上皮組織中Caspase-7蛋白呈高表達趨勢，其陽性表達率顯著高于正常外耳道皮膚組織，提示Caspase-7蛋白在中耳膽脂瘤的發生發展中起到重要作用。

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