植酸酶工程菌產酶條件優化研究

楊俊慧，公維麗，楊艷，孟慶軍，史建國

( 齊魯工業大學(山東省科學院)，山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014)

在植物種子中植酸(肌醇六磷酸)是磷的主要儲存形式，占磷總量的60%～80%，但是單胃動物不能直接降解利用植酸中的磷，需要外源添加磷以補充磷元素的缺乏，這不但增加了飼養行業的成本，而且未被吸收的植酸被排出體外可以進一步被土壤微生物降解產生磷，不僅造成磷的流失，而且嚴重污染環境[1]。同時植酸是強螯合劑，可以螯合Ca2+、 Zn2+和 Fe2+等多種重要金屬離子，也可以作為抗營養因子在酸性或堿性條件下與蛋白或氨基酸形成復合物，這也導致部分營養物質不能被充分吸收利用[2]。

植酸酶(EC 3.1.3.8,EC 3.1.3.26，EC 3.1.3.72,肌醇六磷酸磷酸水解酶)是催化植酸或植酸鹽中磷酸基團逐步釋放的一類酶分子，研究顯示將植酸酶添加到單胃動物(如豬、家禽和魚類)飼料中可以提高其利用磷和營養元素的效率。 Simons等[3]研究發現將微生物植酸酶粗酶液加到豬飼料中可以使磷的吸收效率提高24%，而排泄物中磷可以降低35%，類似的結果也相繼在多項研究中得到證實。

植酸酶廣泛存在于自然界中，在動物、植物和微生物中都有分布，但是科學研究所用的植酸酶通常為無花果曲霉(Aspergillusficuum)、梨形毛霉(Mucorpiriformis)和枝孢屬(Cladosporiumspecies)等絲狀真菌來源的，首次投入市場的植酸酶分離自AspergillusnigerNRRL 315 (ATCC 66876)。從植酸酶作為動物飼料添加劑得到廣泛應用以來，還在水產養殖、人類營養等方面得到廣泛關注。天然來源的植酸酶通常在熱穩定性、pH耐受范圍和比活力等方面有一定的局限性，通過遺傳分子改造和轉基因方法將植酸酶基因在酵母等細胞內異源表達已經證明是一種獲得性質優良酶分子的有效方法[4]，但是工程酵母菌的產酶量會受多種因素影響，為探究影響植酸酶酵母工程菌的產酶因素，優化發酵工藝，本研究以搖瓶發酵對酵母工程菌產植酸酶的最佳甲醇誘導量、誘導時間等因素進行了深入分析。

1 實驗材料和儀器

1.1 試劑

酵母粉、蛋白胨、無氨基酵母氮源YNB(含硫酸銨)、生物素、丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基苯磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(生工生物工程(上海)股份有限公司)、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、甲醇、甘油、釩酸銨、鉬酸銨、硝酸、乙酸、乙酸鈉(國藥集團化學試劑北京有限公司)、植酸鈉(美國Sigma公司)。

1.2 菌種、培養基和終止顯色溶液

畢赤酵母GS115產植酸酶工程菌(山東省科學院生物傳感器實驗室構建)；畢赤酵母GS115原始菌株(上海柯雷生物科技有限公司)保存在-20 ℃、20%甘油管中。

YPD培養基(1 L)：10 g酵母粉，20 g蛋白胨，10 g葡萄糖。

BMMY培養基(1 L)：13.4 g 無氨基酵母氮源YNB，11.8 g磷酸二氫鉀，2.9 g磷酸氫二鉀，10 g酵母粉，10 g蛋白胨，2 mL 0.2 mg/mL生物素，5 mL甲醇。

BMGY培養基(1 L)：13.4 g 無氨基酵母氮源YNB，11.8 g磷酸二氫鉀，2.9 g磷酸氫二鉀，10 g酵母粉，10 g蛋白胨，2 mL 0.2 mg/mL生物素，10 mL甘油。

鉬酸銨溶液(100 g/L)： 稱取10 g鉬酸銨溶于適量去離子水中，加入1 mL氨水，定容到100 mL。

釩酸銨溶液(2.35 g/L)：稱取0.235 g釩酸銨溶于適量蒸餾水中，60 ℃水浴2 h后，邊快速攪拌邊緩緩加入2 mL硝酸溶液，定容至100 mL。

1.3 儀器

Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳儀(美國Bio-rad公司)；搖床(上海知楚儀器有限公司)；TECAN酶標儀(瑞士TECAN公司)。

2 實驗方法

2.1 酵母菌株平板培養方法

將保存在甘油管中的畢赤酵母GS115產植酸酶工程菌和畢赤酵母GS115原始菌株菌液用接種環在YPD平板上劃線，30 ℃培養24 h。

2.2 搖瓶培養方法

從平板培養基上分別挑取酵母單克隆接種于5 mL YPD液體培養基中，在30 ℃，200 r/min條件下培養24 h； 取200 μL 24 h培養菌液轉接于30 mL BMGY液體培養基中，于30 ℃，200 r/min培養至OD600=1.6；4 830 r/min，離心5 min, 去上清，用BMMY液體培養基重懸菌體OD600=1.0，然后全部轉移到300 mL BMMY液體培養基中，在30 ℃，200 r/min，振蕩培養，每隔24 h分別補加0.5%、1.0%、1.5% 和2.0% 甲醇(3 mL)，連續培養5 d，每天補加甲醇前取樣。

2.3 酶液透析方法

分別取20 mL發酵酶液加入透析袋中，置于0.2 mol/L Tris-HCl (pH7.0)緩沖液中透析，透析時間分別設定為2 h、4 h、6 h、8 h。

2.4 蛋白及酶活測定方法

蛋白測定采用考馬斯亮藍染色法[5]，利用1 mg/mL牛血清白蛋白測定標準曲線，樣品測定反應體系為100 μL發酵液加1 mL考馬斯亮藍，在室溫(25 ℃)，反應10 min，于595 nm測定吸光度值；

酶活測定采用鉬釩酸銨法[6]，利用50 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液制作標準曲線，酶活測定反應方法見表1。

表1 基于國標標準測定植酸酶酶活方法(小體系)Table 1 Determination of phytase activity according to national standard (small reaction system)

2.5 SDS-PAGE檢測蛋白表達方法

SDS-PAGE[7]檢測蛋白表達方法中分離膠(12%，5 mL)配制方法為：2.1 mL H2O，1.5 mL 40% 丙烯酰胺，1.3 mL 1.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)，0.05 mL 10% SDS，0.05 mL 10% 過硫酸銨，0.002 mL TEMED；濃縮膠(1 mL)配制方法為：0.725 mL H2O，0.125 mL 40% 丙烯酰胺，0.13 mL 1.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)，0.01 mL 10% SDS，0.01 mL 10% 過硫酸銨，0.001 mL TEMED；電泳過程樣品上樣量為20 μL。

2.6 甘油含量測定方法

甘油含量測定采用甘油銅比色法[8]，取硫酸銅溶液(0.05 g/mL)1 mL與堿液(0.05 g/mL)3.5 mL，搖勻，加入待測酶液樣品，振蕩12 min，離心過濾，后在波長為630 nm處測定吸光度，并以0.002 g/mL、0.004 g/mL、0.006 g/mL、0.008 g/mL、0.010 g/mL和0.012 g/mL甘油做標準曲線。

2.7 還原糖、乳酸含量測定方法

利用本實驗室自主研發的SGD還原糖測定儀測定發酵液中還原糖含量；SBA-4D型生物傳感器測定乳酸含量。

3 結果與分析

3.1 菌體培養

為確定植酸酶工程菌的產酶能力，本研究首先選用畢赤酵母GS115原始菌株(圖1a)和植酸酶工程菌株(圖1b)分別進行誘導產酶培養。從圖1可以看出無論是隨著培養時間增加、 直接在BMGY培養基中加入甲醇誘導還是將BMGY培養到一定菌濃度轉接到BMMY培養基加入甲醇誘導，畢赤酵母GS115原始菌株都不能分泌植酸酶(圖1c1、1c2、1c3、1c6、1c7、1c8)，而植酸酶工程菌明顯可以分泌植酸酶(圖1c4、1c5、1c10)。這說明我們的植酸酶工程菌構建成功，具有植酸酶產酶能力。同時，從圖1c4、1c5、1c9、1c10可以看出，直接在BMGY培養基中加入甲醇誘導時，BMGY培養基中的殘留甘油會使植酸酶產生延遲，而且植酸酶產酶量隨著誘導時間增加逐漸積累。

a YPD固體培養基培養畢赤酵母GS115原始菌株；b YPD固體培養基培養植酸酶工程菌株；c SDS-PAGE檢測利用BMGY和BMMY培養基對兩株菌誘導產酶培養結果。圖1 畢赤酵母GS115原始菌株和植酸酶工程菌株平板培養及誘導產酶效果比較Fig.1 Comparison of plate culture and phytase production between original strain and engineered strain of Pichia pastoris GS115

3.2 生化培養參數測定

菌體在產酶過程中會通過消耗碳源(甲醇、甘油、還原糖等)代謝產生乳酸、植酸酶等產物，通過對不同濃度甲醇連續誘導培養5 d條件下甘油、還原糖及乳酸含量測定，發現甘油含量隨著培養時間延長逐漸降低(圖2a、 2b)，而培養基中基本沒有還原糖存在(圖2c)，且產生的乳酸量也較低(圖2d)。

a甘油含量檢測標準曲線圖；b培養基中甘油含量隨培養時間變化；c 100 mL培養基中還原糖質量隨培養時間變化；d 100 mL培養基中乳酸質量隨培養時間變化。圖2 時間序列培養植酸酶工程菌關鍵生化培養參數測定Fig.2 Determination of key biochemical culture parameters of engineered phytase production strain under time-course cultivation

3.3 植酸酶工程菌不同濃度甲醇誘導酶活測定

國標法測定植酸酶酶活是通過酶解植酸鈉底物產生的磷酸量反映，但是在BMGY和BMMY培養基中存在大量磷酸根離子，這一部分磷酸根可以與顯色劑發生顏色反應，產生強烈的背景色導致酶與植酸鈉產生的磷酸根被掩蓋，無法對植酸酶酶活準確測定。因此，本研究采用透析法去除培養基中的磷酸根，并對可以較完全去除磷酸根的透析時間進行探索。如圖3a所示，隨著透析時間延長，磷酸根的量逐漸降低，透析6 h磷酸根量基本達到穩定，因此后續酶活測定采用透析6 h酶液。

利用透析6 h酶液測定酶活結果顯示(圖3b)，當以1.5% 甲醇誘導時，測定的酶活最高，到第2天酶活就可以達到約1 100 U/mL，并且此后酶活基本保持穩定。當以0.5%、1%甲醇誘導時，酶活隨著培養時間延長逐漸增加，到第4天基本穩定，但是最高酶活僅約為290 U/mL。而以2% 甲醇誘導時，酶活最高可達280 U/mL，且在前2天較高，隨后逐漸降低。

a 利用透析方法有效去除植酸酶酶液中背景磷酸根時間；b 植酸酶酶活測定。圖3 透析去除植酸酶酶液中磷酸根及植酸酶酶活測定Fig.3 Removal of phosphate root in phytase solution by dialysis and determination of phytase activity

3.4 SDS-PAGE檢測植酸酶產量

利用SDS-PAGE對不同濃度甲醇時間序列誘導植酸酶工程菌產酶量檢測，發現甲醇的濃度、誘導培養時間都會對植酸酶誘導產量產生重要影響。其中利用0.5%、1%、1.5% 甲醇誘導，產酶量都會隨時間延長逐漸累積，0.5% 甲醇誘導在第3天才明顯檢測到酶條帶，而1% 和1.5% 甲醇誘導在第2天可以檢測到明顯酶條帶，但是1.5% 甲醇誘導產酶量較1%甲醇誘導產生的大，而以2% 甲醇誘導可在第2天檢測到酶條帶，但隨著時間延長，條帶逐漸減弱，說明酶量逐漸降低。綜合比較結果表明，1.5% 甲醇可以快速、高效誘導植酸酶工程菌產酶，到第3天基本達到穩定酶量，SDS-PAGE蛋白譜結果和酶活測定結果一致(圖4)。

a 0.5%甲醇誘導培養；b 1%甲醇誘導培養；c 1.5%甲醇誘導培養；d 2%甲醇誘導培養。圖4 SDS-PAGE檢測不同濃度甲醇時間序列誘導植酸酶工程菌產酶量Fig.4 Time-course detection of phytases produced by engineered strain induced with different concentrations of methanol by SDS-PAGE

4 討論

從1991年Gist Brocades公司首次將植酸酶產品投入飼料市場以來，許多公司試圖通過構建植酸酶基因工程菌獲得種類更多的植酸酶產品[9]，但是當前市場上可獲得的僅有少數幾種，目前普遍面臨的問題是如何最大限度地提高植酸酶工程菌發酵產量，前期一些研究結果顯示菌體自身特性如啟動子強度、密碼子偏好性等因素會影響植酸酶產量，同時發酵條件對植酸酶產量也有重要影響[10]。

本研究利用搖瓶發酵，對構建的植酸酶畢赤酵母工程菌最佳甲醇誘導劑添加量、誘導培養時間等因素進行探討，結果顯示，1.5% 甲醇添加量具有最佳誘導效果，大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因(AOX1)，在該基因的啟動子(PAOX1)作用下，外源基因得以表達，當甲醇濃度太低時，對啟動子啟動效果不強；但當甲醇濃度太高時，對甲醇的代謝不完全，導致甲醇累積，對菌體產生毒性，部分菌死亡、細胞裂解，蛋白酶等內溶物釋放可能將產生的少量植酸酶酶解，所以檢測到SDS-PAGE上蛋白條帶減弱。同時酶蛋白的產生是逐漸累積的過程，到第3天蛋白量基本達到穩定，但繼續通過條件優化使蛋白產量在最短時間內達到最高產量，可在植酸酶生產上大大節省人力、物力。

目前高密度發酵工藝已成為生物技術中進行中試生產的主要發酵工藝[11]，本研究實驗結果為植酸酶工程菌高密度發酵條件優化奠定了基礎。