氫核磁定量分析技術(shù)測定人參皂苷Rd對照品含量的研究

閆慧嬌，王志偉，林云良，高紅梅，李鋒，王曉，耿巖玲

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)，山東省分析測試中心，山東省科學院中藥過程控制研究中心，山東 濟南 250014)

人參(Ginseng Radix et Rhizoma)為五加科人參屬植物人參(PanaxginsengC.A.Meyer )的干燥根和根莖[1]，傳統(tǒng)名貴中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，載其“味甘，微寒，主補五臟，安精神，開心益智，久服輕身延年”，中國藥典2015版載其“大補元氣，復脈固脫，補脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智”，為廣為認可的補益藥之一。人參的特征性化學成分主要為四環(huán)三萜達瑪烷型人參皂苷(ginsenoside)[2]，具有改善免疫功能、提高記憶、延緩衰老、改善心血管功能等作用。

目前人參皂苷含量測量主要使用反相高效液相色譜儀或者超高效液相色譜儀，配合DAD或者ELSD檢測器，以及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行測定[3-7]。這些分析測試方法均需要與標準品對照，且目標物與雜質(zhì)色譜響應(yīng)值的差異，可能使其準確性受到一定影響。氫核磁定量分析技術(shù)(quantitative hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy)是基于核磁共振原理的一種定量分析方法，其原理是不同化學環(huán)境的氫原子的共振峰面積，只與其原子數(shù)目有關(guān)[8]。方法簡單、快捷，不破壞樣品，可以不使用待測組分的對照品，而使用已知含量的普通化學物質(zhì)為參比，相比于高效液相色譜法、氣質(zhì)及液質(zhì)聯(lián)用等定量技術(shù)具有獨特的優(yōu)勢。隨著核磁靈敏度的提高，定量核磁技術(shù)的準確度已被廣泛用于化學對照品，中藥材等的定量分析[9-11]，先后被美、英及歐洲藥典收錄[12-13]，《中國藥典》自2010版[14]也已收錄該方法。但目前沒有運用氫核磁定量分析技術(shù)對人參皂苷含量測定的相關(guān)報道。本研究采用核磁共振內(nèi)標法測定了人參皂苷對照品的含量，建立了在無需使用對照品的情況下對人參皂苷進行質(zhì)量控制和含量測定的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker BioSpin 400 MHz NMR spectrometer(德國Bruker公司)；Sartorius SQP精密天平(德國Sartorius公司)；單通道可調(diào)微量移液器(德國Eppendorf公司)；Aglient 1260 HPLC(配Aglient 385 ELSD檢測器，美國Aglient公司)。

氘代二甲亞楓(氘代度>99.9%，美國CIL公司)；氘代D2O(氘代度>99.9%，美國CIL公司)；苯甲酸(Pcode 1002325760，純度99.5%，美國Sigma公司)；人參皂苷Rd對照品。人參皂苷Rd和苯甲酸的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 人參皂苷Rd和苯甲酸的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of ginsenoside Rd and benzoic acid

1.2 實驗條件

核磁定量實驗要求所有測試圖譜均在同一測試條件下完成。本實驗核磁共振(NMR)采集條件：測定溫度25 ℃，觀測頻率400.13 MHz，脈沖序列zg，脈沖寬度11.800 0 μs，采集時間4.089 4 s，測定樣品的NMR譜圖。

考察累加次數(shù)設(shè)定為8、16、32、64、128，實驗結(jié)果顯示累加次數(shù)的改變對樣品定量峰與內(nèi)標物定量峰積分面積比值無明顯影響，所以選擇累加次數(shù)32。見圖2a。

考察弛豫時間設(shè)定1 、3 、5、10 、20 s時被測樣品定量特征峰的峰面積，選擇峰面積不再增加的值為實驗參數(shù)，確定弛豫時間為5 s。見圖2b。

1.3 實驗方法

式中，ws為樣品的質(zhì)量分數(shù)；wr為內(nèi)標物質(zhì)量分數(shù)；As和ns分別為被測定樣品的定量峰積分面積及定量峰包含質(zhì)子數(shù)；Ar和nr分別為內(nèi)標物質(zhì)的定量峰積分面積及定量峰包含的質(zhì)子數(shù)；Ms為被測樣品分子質(zhì)量；Mr為內(nèi)標物質(zhì)的分子質(zhì)量；ms為樣品的質(zhì)量；mr為稱取的內(nèi)標物質(zhì)量。

a 累加次數(shù)考察圖譜；b 弛豫時間考察圖譜。圖2 實驗條件考察的圖譜Fig.2 Determination of experimental conditions using 1H NMR spectrum

2 實驗結(jié)果

2.1 氘代溶劑、內(nèi)標物和定量峰的選擇

2.2 線性關(guān)系考察

制成6種不同濃度的待測樣品溶液，依照1.2的核磁共振采集條件，測定樣品的1H NMR譜。分別測定人參皂苷Rd和苯甲酸定量信號峰積分面積，具體結(jié)果如表1所示。

以人參皂苷Rd、苯甲酸1H NMR定量峰面積比為縱坐標y，以人參皂苷Rd、苯甲酸質(zhì)量比為橫坐標x做線性關(guān)系圖，得回歸方程為y=0.065 8x+0.004 5，相關(guān)系數(shù)R=0.997 8。結(jié)果表明，采用氫核磁定量技術(shù)對人參皂苷Rd的含量進行測定，線性關(guān)系良好。

a 人參皂苷Rd部分H譜(dDMSO)；b 人參皂苷Rd和苯甲酸混合物(dDMSO)；c 人參皂苷Rd和苯甲酸混合物(dDMSO+D2O)。圖3 核磁共振氫譜法測定人參皂苷Rd含量的圖譜Fig.3 Determination of ginsenoside Rd using 1H NMR spectrum

表1 人參皂苷Rd和苯甲酸的質(zhì)量及峰面積積分值Table 1 Mass and integral value of peak area of Ginsenoside Rd and benzoic acid

2.3 精密度實驗

取2.2項下的3號樣品，在選定的同一實驗條件下，連續(xù)測定6次，人參皂苷Rd和苯甲酸定量峰的積分面積的相對標準偏差分別為0.97%和0.85%，表明重復性好。

2.4 穩(wěn)定性實驗

取2.2項下的3號樣品，分別于0 、2、4 、6 、8 、10 h測定其人參皂苷Rd和苯甲酸定量峰的積分面積的相對標準偏差，為0.77%和0.68%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)測定穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率實驗

采用加標回收率方法測定不同濃度人參皂苷Rd的回收率，結(jié)果顯示，120%，100%及80%的加標量的回收率分別為98.69%，102.54%，101.01%，平均回收率為100.75%，相對標準偏差為1.92%，說明該法準確性良好。

2.6 樣品測定

取3個批次的人參皂苷Rd對照品，依照上述1.2和1.3實驗條件和實驗方法，測定對照品與苯甲酸特征峰的峰面積，按照1.3公式計算，可得人參皂苷Rd對照品的絕對質(zhì)量分數(shù)，同時采用高效液相峰面積歸一化法測定其相對質(zhì)量分數(shù)。測定結(jié)果如表2所示。從表2數(shù)據(jù)對比可看出，HPLC法測定得到的人參皂苷Rd的質(zhì)量分數(shù)略高于氫核磁定量法，主要是由于人參皂苷Rd對照品中殘留溶劑及殘留水分無色譜響應(yīng)，而氫核磁定量技術(shù)測定時去除了人參皂苷Rd所含溶劑及水分，只測定了絕對含量。

表2 3批人參皂苷Rd對照品含量測定結(jié)果(質(zhì)量分數(shù)/%)Table 2 Determination result for the control content of ginsenoside Rd

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，采用氫核磁定量技術(shù)對人參皂苷Rd含量進行測定，線性關(guān)系、精密度和穩(wěn)定性均良好。氫核磁定量技術(shù)不依賴色譜分離，基于質(zhì)子的響應(yīng)而實現(xiàn)定量，信號無選擇性響應(yīng)。定量核磁技術(shù)相比于經(jīng)典的高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用等方法，不依賴于被測物的高純標準品進行定量分析，不需要繪制標準曲線[16]。此外，該方法同時可體現(xiàn)提取物結(jié)構(gòu)信息，可在定量同時具有一定定性特征。然而定量核磁技術(shù)也存在著自身的局限性，使用定量核磁則待測物中須有分離度較好信號，若圖譜信號重疊，則限制了該方法的應(yīng)用。隨著核磁共振技術(shù)的不斷發(fā)展，氫核磁定量技術(shù)在定量分析中也需要進一步研究和發(fā)展。