母嬰分離方法制備產后抑郁大鼠模型的行為學及海馬病理變化的觀察

李凈婭 章正祥? 戚觀樹 楊歆科

產后抑郁癥（PPD）是指產婦在分娩后出現情緒低落，精神抑郁為主要癥狀的病癥［1］。PPD動物模型單一，Galea等［2］于2001年制備的激素撤離模型是迄今唯一的較為成熟的PPD模型。2007年，Boccia Maria L等［3］發現產后被長時間母嬰分離的母鼠在強迫游泳實驗中有類似抑郁癥狀的表現。隨后其他一些研究亦證明了這一現象，并且抑郁癥狀在分離后數周仍持續存在。而Toigo EP［4］則以類似方法造模，強迫游泳結果亦顯示，在產后35d母嬰分離的母鼠不動時間延長，并發現其海馬內鈉鉀ATP酶活性增強，一氧化氮含量下降。有研究［5］顯示暴露在壓力環境下，鈉、鉀ATP酶活性只會持續增強數小時，而持續性的鈉、鉀ATP酶活性降低是抑郁證的一個重要指征，其活性可被抗抑郁藥如弗洛西汀和西斯帕明改善。諸多研究均指示母嬰分離可能是一個較好的，單純社會因素造模的產后抑郁模型。但是目前關于母嬰分離PPD模型的研究國外多局限于行為學的觀察，且在國內尚屬空白領域。本研究目的旨在觀察母嬰分離母鼠海馬的病理結構的改變以及與各行為學實驗的評價結果，為母嬰分離PPD模型的制備提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD雌性大鼠，孕期16～17d，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2012-0001。

1.2 實驗儀器 大鼠場箱：高40cm、長80cm、寬80cm，內空，箱壁四周黑色，底面用黑線均勻劃分為相等面積的25塊方格；高架十字迷宮架：由相對開放臂（50cm×l0cm）和兩條相對閉合臂（50cm×40cm×10cm）以及中央區（10cm×l0cm）連接而成，材質采用高級醫用有機板制作，接觸面不反光，可使用酒精清洗除味；以上兩者均由北京中醫藥大學基礎醫學院診斷教研室提供；強迫游泳水缸：直徑25cm、高度60cm、水深35 cm 的圓柱形筒。自制懸尾箱［6］：高60cm、長100cm、寬60cm，硬紙板五面封閉，朝天花板的一面的正中有小孔，便于固定大鼠尾部，朝向觀察者的一面開放；Finesse 325 型旋轉石蠟切片機：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；倒置式生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司（CKX41S）；圖像采集系統：日本尼康公司（Digital Sight DS-U2）。

1.3 實驗方法 購入20只大鼠，對其進行編號（標號為1～20號），適應性喂養，待產。隨機選取16只大鼠，將生產當天記為Day0，于Day1-Day14的每天9：00將母鼠拿出飼養籠單獨置于分離籠內，籠內正常放置食物和水，乳鼠被留在原飼養籠內。分離時段內放置母鼠的分離籠與原飼養籠共置一室，使母鼠可以嗅到乳鼠氣味，聽到乳鼠聲音。其余4只產后大鼠（標號為1、2、12和17號）作為空白對照，與乳鼠不作任何分離，其他時間段無關人員不得接近飼養籠，以免干擾動物。于第14天分離結束后對20只母鼠行曠場實驗評價，根據曠場水平得分、垂直得分、曠場移動平均速度、曠場移動總路程和中央區停留時間為因子采用K-聚類分析進行分類。母鼠于第21天再次進行各行為學實驗觀察（包括曠場實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗、高架十字迷宮實驗），于第50天取大腦海馬觀察HE染色結果。

1.4 觀察方法 （1）行為學觀察：曠場試驗（OFT）：于隔音的光亮環境下，測試前保持敞箱內潔凈，每只大鼠測5min，記錄水平活動與垂直活動得分：水平活動得分：動物穿越方格數（大鼠四肢均進入方格內為準）；垂直活動得分：大鼠直立次數，以大鼠的兩前肢離地計為1次。強迫游泳測試（FST）：將各組大鼠在安靜狀態下分別進行預游泳 15min（水溫24℃～25℃）。結束后，用毛巾將鼠毛擦干，置于28℃的環境中 30min 后放回鼠籠。24h后進行正式游泳，在同一時間、同樣條件下重復游泳 5min，并以秒（s）為單位記錄5min內大鼠所呈現的不動（直立漂浮狀態）和掙扎（四肢攀爬缸壁）狀態。懸尾實驗（TST）：在暗光、無噪聲的環境下進行，操作者握住大鼠的尾巴根部1/ 3處，將大鼠頭部向下，固定在大鼠懸尾箱內，采用雙盲法觀察3min。記錄：①不動時間：指大鼠處于完全放松靜止不動狀態的累積時間；②掙扎次數：指大鼠由倒掛向上翻轉的總次數。高架十字迷宮實驗（EPM）：將大鼠置于迷宮中央，頭朝開臂，觀察者距離迷宮中心≥1m。記錄5min內大鼠進入開臂和閉臂的次數和在兩臂滯留時間（以四肢全部入臂為準）。計算大鼠進入開臂次數和在開臂滯留時間分別占總次數（進入開臂和閉臂次數之和）和總時間（在開臂與閉臂滯留時間之和）的百分比（即OE%和OT%）。每次實驗完成后將大鼠取出，清理兩臂并噴灑酒精除去氣味。（2）腦組織病理形態觀察：于第50天即造模結束1個月后將20只母鼠，予 10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.4ml /100g），斷頭取腦，放入盛有4%的福爾馬林固定液中固定2周后，常規脫水、透明、石臘包埋、切片（6μm）。常規HE染色。光鏡下觀察大腦海馬組織神經細胞結構，并攝片。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分組結果 根據曠場水平得分、垂直得分、曠場移動平均速度、曠場移動總路程和中央區停留時間為因子采用K-聚類分析分出2組：一組包括9只，鼠號為：12，14，9，2，17，18，13，16，1號，其中全部 4只空白對照大鼠（鼠號1，2，12和17號）均在組1，故定為正常組；另一組包括11只，鼠號為：3，5，4，7，20，8，10，15，19，11，6 號，定為 PPD 組。

2.2 兩組大鼠在造模后1周時點的行為學觀察結果 產后抑郁組體重變化程度明顯高于正常組，并且水平及垂直分數明顯較正常組降低。產后抑郁組懸尾實驗中不動時間明顯增加（p＜0.01），強迫游泳不動時間也有延長趨勢，但尚未達到統計學意義。在十字迷宮測試中，與正常組比較，產后抑郁組大鼠在閉臂停留時間明顯增加，在開臂停留時間明顯減少，并且進入開臂閉臂總次數也明顯降低（p＜0.01）。見表1。

2.3 兩組大鼠在造模后第4周時點的腦組織病理形態結果 正常組海馬神經元細胞數量多，結構完整，排列整齊，胞漿豐富飽滿，胞核染色清晰均一。模型組在造模結束第4周的HE染色結果顯示，海馬細胞數量明顯減少，細胞間隙大，排列較空白組疏松，細胞淡染，著色不均，細胞核固縮明顯。見圖1～4。

表1 兩組大鼠在造模后1周時點的行為學觀察結果（x±s）

圖1 PPD組大鼠海馬HE染色（100×）

圖2 PPD組大鼠海馬HE染色（400×）

圖3 正常組大鼠海馬HE染色（100×）

圖4 正常組大鼠海馬HE染色（400×）

3 討論

產后抑郁發病原因由內在生物變化因素和社會因素導致。眾多研究［7-8］已經表明，產后雌、孕激素的撤退是導致產后抑郁發生的一個重要因素，Galea等［2］根據這一原理制備產后抑郁大鼠模型，通過激素模擬大鼠懷孕時的體內激素狀態，發現大鼠在激素撤退第2天，強迫游泳實驗不動時間延長。至今為止激素撤離產后抑郁模型是唯一公認的較為成熟的模型。

但是與生物學因素比較，社會因素在人類產后抑郁發病因素中起著同等重要的地位。相對于通過模擬大鼠的產前、產后體內激素變化狀態來制備產后抑郁模型，考慮是否可以通過模擬人類社會因素成功制備產后抑郁模型。臨床上顯示新生兒在監護室育養而導致母嬰分離的產婦得抑郁癥概率增加［9］。隨后有研究顯示，母嬰分離3h/d的母鼠有抑郁表現且鈉鉀離子通道改變［5］。本研究對新產大鼠進行母嬰分離后，將20只大鼠（包括4只未分離大鼠）造模結束時OFT的水平分數、垂直分數、中央區停留次數、中央區停留時間、平均移動速度五個指標為因子聚類分析后發現，20只大鼠可以分為兩組，產后抑郁組（11只），正常組（9只，包括未分離大鼠4只），由此計算出68.75%的母嬰分離母鼠有明顯的抑郁表現。隨后通過進一步對造模結束1周后兩組各行為學評分進行比較，結果顯示兩組OFT、TST、EPM指標均有差異，產后抑郁組較正常組體重波動明顯，并且在造模結束4周后海馬HE染色仍有神經元受損的表現。曠場試驗是抑郁大鼠行為學觀測常用的方法，水平分數降低代表大鼠的行動能力下降，垂直分數的降低代表探索能力的下降，同時在強迫游泳與懸尾實驗中不動時間增加意味抑郁大鼠的絕望程度。而EPM實驗的陽性結果則提示，經過母嬰分離的母鼠不僅有抑郁的表現，還有焦慮的表現，這也與臨床中產后抑郁與焦慮常合并的現象吻合。并且不少實驗研究［10］均已發現抑郁大鼠海馬神經元減少，細胞核固縮，這也與本實驗結果契合。以上結果均說明母嬰分離可能是一個較好的能模擬抑郁核心癥狀以及病理表現的產后抑郁模型。

然而由于仍有一些大鼠抑郁表現并不明顯，此方法仍需要進一步改進，將分離2周延長至3周，每天的分離時間亦延長至4h，分離3周后繼續單籠飼養可能會增加模型的成功率。因此關于此模型有必要進一步的探索實驗。